Metode za selektivno izdvajanje i ispitivanje funkcija ćelija prirodnog i adaptivnog imuniteta

Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija: Izdvajanje ćelija U istraživačkom i kliničkom radu najčešće se koriste prečišćene populacije odgovarajućih ćelija Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija: Na osnovu različitih fizičkih osobina Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula

1. Na osnovu fizičkih osobina (gustina, adhezivnost) a) Izdvajanje ćelija na gustinskom gradijentu b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti

a) Izdvanaje ćelija na gustinskom gradijentu Različita gustina i težina ćelija Uzorak: periferna krv, tkivni homogenat... Grdaijenti: Ficol, Perkol, Opti prep, Nyco prep... Uslovi razdvajanja: temperatura, rpm, odnos zapremine gradijenta i uzorka (prema preporuci proizvodjača)

Izolacija mononuklearnih ćelija na gustinskom gradijentu https://www.youtube.com/watch?v=6lsldFFMEhE

Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita (10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4) (kultivacija, 6 dana) stimulacija različitim Imunomodulatorima, kultivacija -Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija) -Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC -Produkcija citokina od strane MoDC -Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih karakteristika MoDC

b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti Adherencija za plastiku ili staklo Adherentne ćelije – makrofagi, DĆ Neadherentne ćelije – T limfociti

2. Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula Ćelijski markeri: CD3, CD21, CD11c, CD11b... Antitela specifična za ćelijske markere Izvor ćelija: periferna krv, ćelije kosne srži, limfnih čvorova,slezine

2. Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula Metod paninga b) Imunomagnetno sortiranje

a) Metod paninga Adherencija za plastične površine obložene antitelima Direktan paning Indirektan paning

b) Imunomagnetno sortiranje Magnetne kuglice obložene antitelima Direktno imunomagnetno sortiranje Indirektno imunomagnetno sortiranje

https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg pipeta ćelija koja ne iskazuje antigen magnetna čestica antitetlo Magnet antigen ćelija koja iskazuje antigen suspenzija ćelija izlaganje magnetu razdvojene populacije ćelija https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg

Testovi za ispitivanje funkcija imunskih ćelija Određivanje broja i vijabilnosti ćelija Testovi za ispitivanje funkcija ćelija prirodnog imuniteta Testovi za ispitivanje funkcija ćelija adaptivnog imuniteta

ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA Brojanje ćelija na hemocitometru/ elektronski brojač Tripan plavo Metilensko plavo Kristal-violet test Propidijum jodid MTT test

MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara aktivnosti mitohondrija Kolorimetrijski test: MTT žute boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance

TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI) NK ĆELIJE

FAGOCITI MAKROFAGI NEUTROFILI Produkcija citokina (IL-12, TNFα...) Fagocitoza Produkcija NO i ROS NEUTROFILI Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...) - Fagocitoza - Produkcija NO, ROS - Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)

1. Određivanje sposobnosti adhezije Ispitivanje adhezije granulocita periferne krvi sa i bez prisustva ConA Kratak opsi procedure: - kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima - dodati PMA (samo u polovinu bunarića) ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije - fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min) - obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min) - isprati boju 3x česmenskom vodom - dodati HCl (200μl, 0,1N HCl) - očitati apsorbancu na 650nm

3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA 2.TEST FAGOCITOZE čestice obeležene fluorohromom, fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS 3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina; ELISA testovi, ELISPOT...

4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test NADPH oksidaza NBT (oksidovana forma žuta) FORMAZAN (redukovana forma, plav→ sivo-crn) Kolorimetrijski test Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS

5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO Griess-ova reakcija (merenje neorganskog nitrata koji je krajnji produkt oksidacije kratkoživećeg NO) 6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE

7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)

NK ĆELIJE Testovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija: 1. Citotoksičnost ( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr) 2. Produkcija citokina (INF-γ) ELISA, ELISPOT

TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA T limfociti test proliferacije T limfocita in vitro detekcija produkcije citokina test citotoksičnosti B limfociti test proliferacije B limfocita in vitro detekcija produkcije antitela

T LIMFOCITI Test proliferacije Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...

-Izolacija mononuklearnih ćelija -Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana -Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina -Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja

MEŠANA LEUKOCITNA REAKCIJA (MLR) Transplantaciona reakcija Limfociti donora i recipijenta Dvosmerna i jednosmerna MLR

Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...) ELISPOT

Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr) Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija

B LIMFOCITI Test proliferacije Produkcija antitela Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A) Produkcija antitela ELISA, RIA, ELISPOT