Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija:

Slides:



Advertisements
Παρόμοιες παρουσιάσεις
Άσκηση 1 Ανασκόπηση ανοσολογικών τεχνικών Ράνια Τσιτσιλώνη.
Advertisements

Test.
Test.
Pritisak vazduha Vazduh je smeša gasova koja sadrži 80% azota, 18% kiseonika i 2% ugljen dioksida, drugih gasova i vodene pare. vazdušni (atmosferski)
ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ
Mικτή Λεμφοκυτταρική Αντίδραση (Mixed Lymphocyte Reaction; MLR)
ΩΡΙΜΑΝΣΗ, ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ Τ ΚΥΤΤΑΡΩΝ
Laboratorijske vježbe iz Osnova Elektrotehnike 1 -Jednosmjerne struje-
Imunski odgovor protiv tumora i transplantiranih tkiva
Laboratorijske vežbe iz Osnova Elektrotehnike
14. nedelja: Pitanja za ulazni test
Vežba 3 – Određivanje tvrdoće prevlaka
ZAGREVANJE MOTORA Važan kriterijum za izbor motora .
Cilj Upoznati se tipovima bolesti uzrokovanih reakcijama preosetljivosti Upoznati se sa etiologijom i patogenetskim mehanizmima svih tipova bolesti uzrokovanih.
NASLOV TEME: OPTICKE OSOBINE KRIVIH DRUGOG REDA
Tehnike u čijoj je osnovi interakcija antigen-antitelo
Uvod u imunologiju i prirodni imunski odgovor
Čvrstih tela i tečnosti
TUMORSKA IMUNOLOGIJA Prof.dr Ivana Hrnjaković Cvjetković
METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJA ĆELIJA PRIRODNOG I ADAPTIVNOG IMUNITETA
TRANSLACIJA (DEGENERACIJA)
Homeostatska funkcija imunskog sistema sisara
SNAGA U TROFAZNOM SUSTAVU I RJEŠAVANJE ZADATAKA
Generator naizmenične struje
PATOGENOST MIKROORGANIZAMA ODBRAMBENI MEHANIZMI DOMAĆINA
VISKOZNOST Tangencijalne sile koje deluju između slojeva tečnosti pri kretanju zovu se viskozne sile ili sile unutrašnjeg trenja.
Grčki alfabet u fizici i matemetici
PROPORCIONALNI-P REGULATOR
ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA U ISTRAŽIVANJU METALA
VREMENSKI ODZIVI SISTEMA
RAZLIČITI PRISTUPI. Eksperimentalni pristupi i postavka eksperimenta u imunološkim istraživanjima.
Aminokiseline, peptidi, proteini
Tehnike u čijoj je osnovi interakcija antigen-antitelo
Merni uređaji na principu ravnoteže
Γαριπίδης Ιορδάνης Βιολόγος 3ο ΓΕΛ Χαϊδαρίου
AAS (Atomska Apsorpciona Spektrofotometrija)
HALOGENOVODONIČNE KISELINE
Merni uređaji na principu ravnoteže
Vijetove formule. Rastavljanje kvadratnog trinoma na linearne činioce
TROUGΔO.
Vijetove formule. Rastavljanje kvadratnog trinoma na linearne činioce
Imunodeficijencije.
VODNI I OSMOTSKI POTENCIJAL BILJNIH ĆELIJA
Elektronika 6. Proboj PN spoja.
LEUKOCITI granulociti, monociti, limfociti
Prof. dr Radivoje Mitrović
FORMULE SUMIRANJE.
Imunološka tolerancija i autoimunost
Strujanje i zakon održanja energije
(mehanizmi odbrane od virusnih, parazitskih i gljivičnih oboljena)
Izolovanje čiste kulture MO
Zašto neka tijela plutaju na vodi, a neka potonu?
Aktivacija i efektorski mehanizmi humoralnog imunskog odgovora
UVOD Pripremio: Varga Ištvan HEMIJSKO-PREHRAMBENA SREDNJA ŠKOLA ČOKA
SREĆNA NOVA
Urođeni imunitet.
5. Karakteristika PN spoja
4. Direktno i inverzno polarisani PN spoja
Polarizacija Procesi nastajanja polarizirane svjetlosti: a) refleksija
Booleova (logička) algebra
Tehnološki proces izrade višetonskih negativa
Dan broja pi Ena Kuliš 1.e.
8 Opisujemo val.
DISPERZIJA ( raspršenje, rasap )
Ασκήσεις Ανοσολογίας Π. Παπαζαφείρη. Α. Φωτεινοπούλου
Pi (π).
-je elektromagnetsko zračenje koje je vidljivo ljudskom oku
Tehnička kultura 8, M.Cvijetinović i S. Ljubović
OŠ ”Jelenje – Dražice” Valentina Mohorić, 8.b
Grupa A - Streptococcus pyogenes
Μεταγράφημα παρουσίασης:

Metode za selektivno izdvajanje i ispitivanje funkcija ćelija prirodnog i adaptivnog imuniteta

Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija: Izdvajanje ćelija U istraživačkom i kliničkom radu najčešće se koriste prečišćene populacije odgovarajućih ćelija Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija: Na osnovu različitih fizičkih osobina Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula

1. Na osnovu fizičkih osobina (gustina, adhezivnost) a) Izdvajanje ćelija na gustinskom gradijentu b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti

a) Izdvanaje ćelija na gustinskom gradijentu Različita gustina i težina ćelija Uzorak: periferna krv, tkivni homogenat... Grdaijenti: Ficol, Perkol, Opti prep, Nyco prep... Uslovi razdvajanja: temperatura, rpm, odnos zapremine gradijenta i uzorka (prema preporuci proizvodjača)

Izolacija mononuklearnih ćelija na gustinskom gradijentu https://www.youtube.com/watch?v=6lsldFFMEhE

Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita (10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4) (kultivacija, 6 dana) stimulacija različitim Imunomodulatorima, kultivacija -Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija) -Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC -Produkcija citokina od strane MoDC -Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih karakteristika MoDC

b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti Adherencija za plastiku ili staklo Adherentne ćelije – makrofagi, DĆ Neadherentne ćelije – T limfociti

2. Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula Ćelijski markeri: CD3, CD21, CD11c, CD11b... Antitela specifična za ćelijske markere Izvor ćelija: periferna krv, ćelije kosne srži, limfnih čvorova,slezine

2. Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula Metod paninga b) Imunomagnetno sortiranje

a) Metod paninga Adherencija za plastične površine obložene antitelima Direktan paning Indirektan paning

b) Imunomagnetno sortiranje Magnetne kuglice obložene antitelima Direktno imunomagnetno sortiranje Indirektno imunomagnetno sortiranje

https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg pipeta ćelija koja ne iskazuje antigen magnetna čestica antitetlo Magnet antigen ćelija koja iskazuje antigen suspenzija ćelija izlaganje magnetu razdvojene populacije ćelija https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg

Testovi za ispitivanje funkcija imunskih ćelija Određivanje broja i vijabilnosti ćelija Testovi za ispitivanje funkcija ćelija prirodnog imuniteta Testovi za ispitivanje funkcija ćelija adaptivnog imuniteta

ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA Brojanje ćelija na hemocitometru/ elektronski brojač Tripan plavo Metilensko plavo Kristal-violet test Propidijum jodid MTT test

MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara aktivnosti mitohondrija Kolorimetrijski test: MTT žute boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance

TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI) NK ĆELIJE

FAGOCITI MAKROFAGI NEUTROFILI Produkcija citokina (IL-12, TNFα...) Fagocitoza Produkcija NO i ROS NEUTROFILI Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...) - Fagocitoza - Produkcija NO, ROS - Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)

1. Određivanje sposobnosti adhezije Ispitivanje adhezije granulocita periferne krvi sa i bez prisustva ConA Kratak opsi procedure: - kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima - dodati PMA (samo u polovinu bunarića) ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije - fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min) - obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min) - isprati boju 3x česmenskom vodom - dodati HCl (200μl, 0,1N HCl) - očitati apsorbancu na 650nm

3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA 2.TEST FAGOCITOZE čestice obeležene fluorohromom, fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS 3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina; ELISA testovi, ELISPOT...

4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test NADPH oksidaza NBT (oksidovana forma žuta) FORMAZAN (redukovana forma, plav→ sivo-crn) Kolorimetrijski test Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS

5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO Griess-ova reakcija (merenje neorganskog nitrata koji je krajnji produkt oksidacije kratkoživećeg NO) 6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE

7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)

NK ĆELIJE Testovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija: 1. Citotoksičnost ( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr) 2. Produkcija citokina (INF-γ) ELISA, ELISPOT

TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA T limfociti test proliferacije T limfocita in vitro detekcija produkcije citokina test citotoksičnosti B limfociti test proliferacije B limfocita in vitro detekcija produkcije antitela

T LIMFOCITI Test proliferacije Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...

-Izolacija mononuklearnih ćelija -Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana -Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina -Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja

MEŠANA LEUKOCITNA REAKCIJA (MLR) Transplantaciona reakcija Limfociti donora i recipijenta Dvosmerna i jednosmerna MLR

Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...) ELISPOT

Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr) Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija

B LIMFOCITI Test proliferacije Produkcija antitela Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A) Produkcija antitela ELISA, RIA, ELISPOT