T un B limfocītu antigēna receptori un palīgmolekulas

APŠ antigēns T limfocīts

Šūnu komunikācija ► Šūnu kontakts caur šūnu virsmas receptoriem: šūnu virsmas proteīni, kuri tiek klasificēti kā CD (= cluster of differentiation) molekulas. APŠ T šūna TCR MHC B7 CD28 ► Šūnu kontakts ar šķīstošo molekulu starpniecību, tādu kā citokīnu (interleikīni-IL) vai hemokīnu (CCR, CXCR). IFN-g APŠ T šūna IL-12

Leikocīti Atkarībā no šūnu diferenciācijas un aktivācijas pakāpes uz membrānas virsmas tiek ekspresētas dažādas molekulas – Cluster of Differentiation (CD) antigens. Tiek detektētas ar anti-leikocītu monoklonālām antivielām (mAb) CD45 ir visām leikocītu grupām

Kā tika piešķirti nosaukumi leikocītu virsmas molekulām? Ņemot vērā funkciju, kuru ietekmē anti- leikocīta monoklonālā antiviela. LFA-1- limfocīta funkciju asociētais antigēns. Anti-LFA1 antivielas traucē limfocītu adhēziju. Zinātniskās grupas piešķir savus nosaukumus, piemēram B7, B220. B nozīmē, ka šīs molekulas biežāk ir ekspresētas uz B šūnu virsmas. Sistemātiski tiek piešķirti CD antigēna numuri

Leikocītu virsmas molekulas Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA) Human Cell Differentiation Molecules (HCDM) organizācija izstrādā CD nomenklatūru raksturo CD molekulas (to struktūru, funkcijas un izplatīšanu) Šūnu virsmas molekula iegūst CD numuru, ja pie tās saistās 2 specifiskas monoklonālās antivielas. Ja, šūnu virsmas molekula vēl nav labi raksturota vai pie tās saistās tikai 1 antiviela, tad CDw (CDw186). 350- 500 molekulas ir jau noraksturotas. Kopsummā leikocītu šūnu virsmas molekulu skaits varētu sasniegt 2500- 4000 molekulas. www.hcdm.org

Antivielas pret CD molekulām CD molekulu skaits CD molekulas pozitīvo šūnu skaits CD pozitīvo šūnu lokalizācija audos Atlasa CD pozitīvās šūnas no šūnu suspensijas Pielietojums: Diagnostikā Terāpijā CD4+ šūnas- HIV infekcijā (AIDS), lai sekotu terapijas efektivitātei un slimību attīstībai. CD64 ekspresija uz neitrofīlu virsmas paaugstinās dažu stundu laikā audu bojājumu vai iekaisumu gadījumā. Izmanto asins saindēšanas diagnozē.

CD antivielu pielietojums terapijā OKT3 , CD3 antivielu, pielieto, lai mazinātu audu atgrūšanas risku Klīnikā esošās antivielas Specifiskums Slimība Antiviela CD4 Psoriāze Imuclone CD20 Artrīts Rituximab CD25 Transplanta atgrūšana Basillximab CD52 Iekaisums Campath-1 CD154 Autoimūnā IDEC-131 CD340 (Her2) Krūts vēzis Herceptin > 200 antivielas ir klīniskajā stadijā

T-šūnas aktivācijai nepieciešams: specifiskā antigēna atpazīšana stabila adhēzija ar APŠ signāla pārnese no šūnas virsmas uz kodolu CD3 T-šūnas receptors TCR z Palīgmolekulas pastiprina signāla pārnesi veido otru signālu nepieciešamo T-šūnas aktivācijai stabilizē T-šūnas piesaisti pie APŠ (adhēzijas molekulas)

T-šūnas receptors (TCR) B-šūnas receptors (BCR;Ig)

T-šūnu antigēna receptors (TCR) atpazīst aminoskābes abos Antigēna peptīdā MHC molekulā Antigēna atpazīšanas specifiskums MHC restrikcija

Self MHC restriction Katra indivīda T-šūnas atpazīst svešus antigēnus TIKAI TAD, ja šie peptīdi ir piesaistīti un izstādīti uz paša indivīda MHC molekulām. Peter Doherty Rolf Zinkernagel 1973-1975.g. atklājumi Nobeļa prēmija 1996. gadā

ab TCR struktūra ķēdes, a un b. Abas ķēdes ir ► 2 transmembrānas polipeptīdu ķēdes, a un b. Abas ķēdes ir kovalenti saistītas ar disulfīdu tiltiņiem. Katra a un b ķēde sastāv no Ig-līdzīgā variablā domēna (V) Ig-līdzīgā konstantā domēna (C) Hidrofobā transmembrānas rajona Īsā citoplazmiskā rajona

ab TCR struktūra Divi īsi enģes (hinge) rajoni ar disulfīdu tiltiņiem kovalenti sasaista a un b ķēdes. Hidrofobais transmembrānas rajons ar pozitīvi lādētu Lys (a ķēdē) vai Lys, Arg (b ķēdē). Šīs pozitīvi lādētas aminoskābes mijiedarbojās ar negatīvi lādētām aminoskābēm, kuras atrodas citos polipeptīdos (CD3), kas ir daļa no TCR kompleksa.

Imunoglobulīnu (Ig) struktūra TCR struktūra BCR Imunoglobulīnu (Ig) struktūra TCR struktūra -S-S- VL CL VH CH1 CH2 CH3 smagā vieglā

TCR variablie rajoni ▶ Trīs komplementaritāti noteicošie rajoni (CDR) a ķēdē. Trīs CDR b ķēdē. Specifiski atpazīst peptīdu – MHC kompleksus TCR vislielākā sekvences dažādība ir koncentrēta CDR3 rajonā. ▶ Ceturtais CDR b ķēdē (nepiedalās antigēna atpazīšanā) Piesaistes vieta mikrobu produktiem – superantigēniem (Staphylococcus aureus enterotoksīni)

Superantigēni Nav nepieciešama superantigēna apstrāde. Savieno T-šūnu ar APŠ tiešā kontaktā vienlaicīgi piesaistoties pie MHCII un TCR. Saistās pie TCR Vb ķēdes tuvu, bet ārpus antigēna piesaistes vietai (CDR rajoniem). Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes enterotoksīni Saista MHCII arī vietā ārpus antigēna piesaistes vietai. MHCII polimorfisms neietekmē šo saistīšanos.

Superantigēni visspēcīgākie T-šūnu mitogēni lai izraisītu efektu pietiek ar niecīgu superantigēnu koncentrāciju- 0.08 pg/ml (21000 molekulas/ml) aktivē līdz 20% naivo T-šūnu (peptīdu antigēns aktivē tikai 1 no 105- 106 naivo T-šūnu) Rezultātā masīva T-šūnu mediātora- IL-2, proinflamatoro citokīnu- TNF-a, IL-1b un hemokīna IL-8 sekretēšana, kuri nonāk asinsritē un izraisa akūto toksisko šoku.

Superantigēni S.aureus producē toksiskā šoka sindroma toksīnu-1 Toksiskā šoka sindroms- drudzis, pazemināts asinsspiediens, izsitumi, galveno orgānu darbību traucējumi. Staphylococcus aureus E.coli enterotoksīni izraisa ceļotāju diareju Saindēšanas ar pārtiku- 1-2h laikā vemšana, diareja. Pietiek ar 1mg toksīna lai izraisītu vemšanu. E.coli

CDR veido virsmu MHC-peptīda atpazīšanai CDRs nodrošina TCR dažādību Tikai 1-2 aminoskābju sānu ķēdes MHC-peptīda kompleksā veido kontaktu ar TCR.

ab TCR struktūra Ir pārāk īsa lai varētu pārnest signālus!!! C-termināla citoplazmatiskā aste ir tikai 5 - 12 aminoskābju gara Ir pārāk īsa lai varētu pārnest signālus!!! Specifiskās molekulas fiziski ir saistītas ar TCR un pilda signāla pārnešanas funkcijas.

TCR saistītās signālmolekulas CD3 z Pēc tam, kad TCR atpazīst un piesaista antigēnu, TCR saistītās signālmolekulas pārnes signālu intracelulāri un aktivē T-šūnu. CD3 un z ir identiskas visām T-šūnām neskatoties uz šūnu specifiskumu

CD3 molekula sastāv no 3 proteīniem: CD3 g, d un e (homoloģiski) Nekovalenti saistītas ar TCR ab heterodimēru N-terminālais ekstracelulārais rajons satur vienu Ig- līdzīgo domēnu Transmembrānas domēns satur negatīvi lādētu asparagīnskābi Citoplazmiskais domēns ir 44-81 aminoskābju garš. Satur konservatīvus motīvus, kuri ir svarīgi signāla pārnesei - ITAM

ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif 6-8 nenosacītas aminoskābes Tirozīns- X-X-leicīns/izoleicīns-X-X-X-X-X-X- Tirozīns-X-X-leicīns/izoleicīns Atrodas citoplazmas astē sekojošām molekulām: z ķēdē Iga un Igb proteīniem Fc receptoriem CD3

z ķēde rajons Transmembrānas rajons satur negatīvi lādētās aminoskābes Īss 9 aminoskābes ekstracelulārais rajons Transmembrānas rajons satur negatīvi lādētās aminoskābes (asparagīnskābi) 113 aminoskābju garš citoplazmas rajons Satur trīs ITAMs Tiek ekspresēta kā homodimērs

CD3 un z proteīnu funkcijas CDR3 un z proteīni savieno TCR antigēna atpazīšanu ar bioķīmiskiem procesiem, kuru rezultātā notiek T-šūnas aktivēšana. CD3 Tyr aminoskābes ITAM motīvā tiek fosforilētas ar Src saimes kināzēm (Lck vai Fyn). Lck ir saistīta ar CD4 vai CD8 molekulu citoplazmisko asti. Fyn ir fiziski saistīts ar CD3 molekulu. ITAM fosfotirozīni saista ZAP-70 molekulu (70kD z-associated kinase), kura aktivē intracelulāros signālpārneses ceļus. Tā rezultātā mainās dažādu gēnu ekspresija.

TCR komplekss Viens CD3 ge heterodimērs Viens CD3 ed heterodimērs Viens ab TCR dimērs Viens CD3 ge heterodimērs Viens CD3 ed heterodimērs Viens disulfīdu tiltiņiem saistītais zz homodimērs

T-šūnas receptors (TCR) B-šūnas receptors (BCR;Ig)

Limfocītu antigēna receptoru īpašības : T-šūnu receptori un imunoglobulīni TCR Ig Sastāv no a un b ķēdēm Smagās un vieglās ķēdēm Ig domēnu skaits 1 V un 1 C katrā ķēdē Smagā ķēde; 1 V, 3-4 C Vieglā ķēde; 1 V, 1 C CDR skaits 3+3 piedalās antigēna saistīšanā. 4 b ķēdē Trīs katrā vieglā un smagā ķēdēs Antigēna afinitāte Kd 10-5- 10-7M 10-7 – 10-11M Saistītas signālmolekulas CD3 un z Iga un Igb Sekretējošā forma Nē Jā Izotipa pārslēgšana

TCR ekspresija Visi TCR kompleksa komponenti tiek sintezēti endoplazmatiskā tīklojumā (ET). Viss TCR komplekss tiek savākts ET un tikai tad tiek transportēts uz T-limfocīta šūnu virsmas.

gd T-šūnu antigēna receptori Tiek ekspresēti uz ab-negatīvām T-šūnām. Mazāk nekā 5% no visām T-šūnām ekspresē gd TCR. Struktūra ir līdzīga ab T-šūnām. gd T-šūnām ir ierobežota dažādība Nejauciet TCR gd ķēdes ar CD3 molekulas gd ķēdēm!!!

gd T-šūnu funkcijas Funkcionē kā limfocīti, kuri iesaistās primārā aizsardzībā pret patogēniem. gd T-šūnas NEatpazīst MHC-saistītos peptīdu antigēnus. gd T-šūnas atpazīst nelielas fosforilētas molekulas, mikrobu alkilamīnus vai lipīdus proteīnus vai neproteīnu antigēnus, kuriem nav nepieciešama antigēnu apstrāde vai APŠ prezentācija mikrobu heat shock proteīnus Spēj uzsākt imūnatbildi pret nelielu daudzumu izplatītāko mikrobu, pirms antigēn-specifisko ab T-šūnu iesaistīšanās.

NK-T-šūnu antigēna receptori Ekspresē virsmas marķierus, kurus parasti ekspresē tradicionālās T-šunas un NK šūnas. Visas NK-T šūnas atpazīst lipīdus, kuri ir piesaistīti pie MHC I klases līdzīgās molekulas – CD1. Aktivētas NK-T-šūnas producē citokīnus IL-4 un IFN-g. Funkcijas: Piedalās imūnatbildē pret dažiem patogēniem Var regulēt adaptīvo imūnatbildi izdalot citokīnus

T-šūnas receptoram ir zema affinitāte pret MHC-peptīda kompleksu. Ir nepieciešamas papildus molekulas, kas pastiprina T-šūnas piesaisti pie antigēn prezentējošās šunas. Koreceptori Kostimulējošie receptori

T-šūnu koreceptori un kostimulējošie receptori Koreceptori- membrānu proteīni, kuri saistās pie MHC molekulas un atpazīst daļu no tā paša liganda, kuru atpazīst antigēna receptors TCR. Koreceptori pastiprina TCR signālpārnesi. Kostimulējošie receptori – atpazīst molekulas uz APŠ virsmas, kuri NAV peptīdu-MHC kompleksa sastāvdaļa.

T-šūnu koreceptori un kostimulējošie receptori

CD4 un CD8 koreceptori CD4 un CD8 saista MHC molekulas nepolimorfos rajonus. Funkcijas: Signāla pārnese antigēna atpazīšanas laikā Pastiprina T-šūnu piesaisti pie APŠ. Nobriedušas ab T-šūnas ekspresē vai nu CD4 vai nu CD8, bet ne abus. 35% CD8 65% CD4

CD4 un CD8 molekulu struktūra monomērs sastāv no 4 Ig-ļīdzīgiem domēniem hidrofobais transmembrānas domēns ļoti bāziska 38 aminoskābju gara citoplazmiskā aste CD8 ar disulfīdu tiltiņiem saistīts heterodimērs (2 radniecīgas ķēdes a un b) katrā ķēdē ir 1ekstracelulārais Ig-līdzīgais domēns hidrofobais transmembrānas domēns ļoti bāziska 25 aminoskābju gara citoplazmiskā aste Transmembrānas glikoproteīni

CD4 un CD8 koreceptori

CD4 un CD8 molekulu funkcijas CD4+ T-šūnas (citokīnus sekretējošie T helperi) piedalās organisma aizsardzībā pret ekstracelulāriem mikrobiem CD8+ T-šūnas (citotoksiskās) novērš intracelulāro mikrobu izraisīto infekciju. CD4 un CD8 piedalās agrīnos signāla pārneses procesos.

T-šūnu specifiskā Src saimes tirozīnkināze – Lck ir nekovalenti, CD3 Lck ZAP-70 T-šūnu specifiskā Src saimes tirozīnkināze – Lck ir nekovalenti, bet cieši saistīta ar CD4 un CD8 molekulu citoplazmātiskajām astēm. Lck fosforilē Tyr CD3 un z ķēžu ITAM motīvos, tādā veidā iniciē T-šūnu aktivācijas kaskādi.

CD4 koreceptors CD4 ir cilvēka imūndeficīta vīrusa receptors. CD4 molekulu skaitu izmanto lai noteiktu kā HIV infekcija progresē indivīdā. HIV uzbrūk un iznīcina tās šūnas, kuras uz savas virsmas ekspresē CD4 molekulas. Normālais CD4 skaits ir 800-1600 Ar HIV AIDS < 200

Naiviem T un B limfocītiem ir nepieciēšami 2 dažādi ekstracelulārie signāli lai iniciētu viņu proliferāciju un diferenciāciju par efektorām šūnām. starp kostimulējošām molekulām Peptīda-MHC kompleksa piesaiste pie TCR. Nodod sekundāros signālus T-šūnu aktivācijai Nodrošina imūnreakcijas specifiskumu

CD28 saimes kostimulējošie receptori Kostimulātori uz APŠ virsmas: B7-1 = CD80 B7-2 = CD86 Kostimulātors uz T-šūnu virsmas : CD28 molecule Ekspresēta uz >90% CD4+ T-šūnām 50% CD8+ T-šūnām B7-CD28 saistīšanās inducē anti-apoptotisko proteīnu ekspresiju Palielina augšanas faktoru un citokīnu produkciju Stimulē T-šūnu proliferāciju un diferenciāciju

CD2 un SLAM saimes kostimulējošie receptori CD2 receptors: glikoproteīns, kas atrodas uz > 90% nobriedušo T-šūnu, 50%-70% NK šūnu virsmas satur 2 ekstracelulāros Ig –līdzīgus domēnus CD2 receptoru ligands ir LFA-3 (CD 58) Leukocyte Function-associated antigen-3 Funkcijas darbojās kā intracelulārās adhēzijas molekulas - kā signāla pārneses molekulas

SLAM –Signaling Lymphocytic Activation Molecule pieder pie CD2 saimes būtisks membrānas proteīns, satur 2 Ig domēnus, un relatīvi garu citoplazmatisko asti Citoplazmas aste satur specifisko Tyr-saistīto motīvu – Immunoreceptor Tyrosine-based Switch Motif (ITSM ir atšķirīgs no ITAM). ITSM saistās pie adaptera - SAP (SLAM- Asociētais Proteīns). SAP satur 2 SH2 domēnus un veido tiltiņu starp SLAM un Fyn (Src saimes kināze, kura ir arī saistīta ar CD3) Kostimulējošie receptori T un NK šūnās un dažās B-šūnās T cell APŠ

Citas T-šūnu palīgmolekulas CD44 Membrānas glikoproteīns, kas ir ekspresēts un nobriedušo T-šūnu, B-šūnu, granulocītu, makrofāgu, eritrocītu un fibroblastu virsmas. Piesaista hialuronātu, kas palīdz noturēt T-šūnas infekcijas vietās audos un piesaistīt aktivētos un atmiņas T-limfocītus pie endotēlija iekaisuma vietās. CD40 ligands (CD40L vai CD154) Trimērs un virsmas proteīns, kas ir ekspresēts uz CD4+ T-sūnām Piesaista CD40 uz APŠ un endotēliju šūnu virsmām T-palīgšūnu efektoro funkciju starpnieks Nāves receptora Fas (CD95) trimēra ligands Fas ligands nodrošina vienu no mehānismiem ar kuru citotoksiskie T-limfocīti nogalina mērķa šūnas. Ir iesaistīts T-šūnas apoptozē.

“Imunoloģīskā sinapse” ir virsma starp APŠ un limfocītu Mijiedarbība starp TCR un MHC molekulām nav stipra Palīgmolekulas stabilizē šo mijiedarbību CD4/ MHC II klases CD8/ MHC I klases CD2/LFA-3 LFA-1/ICAM-1

“Imunoloģiskā sinapse” Par antigēna specifisko piesaisti atbild VIENĪGI TCR Palīgmolekulas ir invariantas Šo molekulu ekspresiju stimulē citokīni

Galvenie etapi T-šūnas aktivācijā APŠ ir jāapstrādā un jāprezentē antigēns T-šūnai T-šūnām ir jāsaņem kostimulējošo signālu - parasti no CD28/B7 Adhēzijas palīgmolekulas palīdz nostabilizēt T-šūnu piesaisti pie APŠ - CD4/MHC-class II - CD8/MHC class I Signāls no šūnu virsmas tiek pārsūtīts uz kodolu - sekundārās signālmolekulas Citokīni stimulē šūnu dalīšanos - IL-2 un citi

Antigēna receptoru gēni B un T limfocītos

Antigēna receptora gēnu ekspresija ir galvenais notikums limfocītu attīstībā/ nobriešanā. Funkcionāls TCR un BCR receptors tiek izveidots nenobriedušos limfocītos T-šūnas: aizkrūts dziedzerī B-šūnas: kaulu smadzenēs

Imunoglobulīnu (Ig) struktūra TCR struktūra BCR Imunoglobulīnu (Ig) struktūra -S-S- VL CL VH CH1 CH2 CH3 smagā vieglā

Ig struktūra Katra ķēde satur: Katrai vieglajai ķēdei ir ►variablo un ► konstanto domēnus -S-S- VL CL VH CH1 CH2 CH3 Katrai vieglajai ķēdei ir ► 1 variablais (VL) un ► 1 konstantais (CL) domēni Variablā daļa ir unikāla katrai antivielai. Konstantā daļa ir diezgan uniforma un ir identiska vienas klases antivielām. Katrai smagajai ķēdei ir ► 1 variablais (VH) un ► 3 vai 4 konstantie (CH) domēni.

Ig struktūra Pastāv 2 veidu vieglās ķēdes : k l Cilvēkam abas ķēdes tiek līdzvērtīgi izmantotas. Pelēm dominē k ķēde. Vistām dominē l ķēde. Vienai antivielai abas vieglās ķēdes ir identiskas k/k vai l/l

nosaka antivielu klases (izotipus) Ig struktūra Pastāv 5 veidu smagās ķēdes : m d g1-4 e a1-2 nosaka antivielu klases (izotipus) IgM IgD IgG IgE IgA

Ig klases Antivielu klase Subklases Funkcijas IgA 2 Atrodas gļotādās, elpceļos, urīnizvadkanālā, siekalās, asarās un mātes pienā. IgE 1 Saista alergēnus un stimulē histamīna izdalīšanos no bazofīliem. Ir iesaistīta alerģiskās reakcijās. Pasargā no parazītiskiem tārpiem. IgD Funkcionē kā antigēna receptors uz B-šūnu virsmas. IgM Ekspresēta kā uz B-šūnu virsmas tā arī sekretētā formā. Likvidē patogēnus humorālās imunitātes sākuma stadijā. IgG 4 Veic galveno imunitāti pret patogēniem. Vienīgā antiviela, kas spēj šķērsot placentu un dot embrijam pasīvo imunitāti.

Cilvēka imunoglobulīnu gēnus kodē 3 saistītas gēnu grupas k vieglās ķēdes gēni 2. hromosomā l vieglās ķēdes gēni 22. hromosomā BCR 1820kb 1050kb Smagās ķēdes gēni 14. hromosomā k/l 1250kb

Cilvēka TCR gēnus TCR b ķēdes gēni a, d ķēžu gēni 7. hromosomā 620 kb 1000kb g d g ķēdes gēni 7. hromosomā 200 kb

Ir 4 TCR ķēdes, bet tikai trīs gēnu lokusi, jo d lokuss ir ieksā α lokusā.

BCR (Ig) ķēdes TCR ķēdes kodē gēnu klāsteri V variablais J savienojuma dažādības C konstantais gēnu klāsteri

Konstantais rajons (CH) -S-S- VL CL VH CH1 CH2 CH3 Vieglā ķēde Smagā ķēde Variablais rajons (VH) Variablais rajons (VL) Tiek kodēts ar 3 dažādiem gēnu klasteriem Tiek kodēts ar 2 dažādiem gēnu klasteriem ▶ VL (variablo) ▶ JL (savienojuma, joining) ▶ VH (variablo) ▶ JH (savienojuma, Joining) ▶ DH (dažādības, Diversity) Konstantais rajons (CL) Konstantais rajons (CH) ▶ CL gēnu segmentu ▶ CH gēnu segmentu

Konstantais rajons (C) Līdzīga Ig smagai ķēdei Ig vieglai ķēdei a vai g ķēde b vai d ķēde Variablais rajons (V a/ g) Variablais rajons (V b/ d) d g Tiek kodēts ar 3 dažādiem gēnu klasteriem Tiek kodēts ar 2 dažādiem gēnu klasteriem V J D V J Konstantais rajons (C) Konstantais rajons (C) C C

V, J un D un C gēnu segmentu skaits un to organizācija variē starp ► dažādiem Ig lokusiem ► dažādām dzīvnieku sugām Kodējošo gēnu segmenti ir atdalīti ar nekodējošiem segmentiem. Šie nekodējošie segmenti spēlē svarīgu lomu gēnu rekombinācijā un ekspresijā.

k vieglās ķēdes gēni signālsekvence (leader) J1-5 Ck V1 V2 V36 V1 V2 V40 ► Satur tikai vienu Ck gēnu ► Klasteri no 5 J (joining) gēniem ► Lielo klasteri no 76 V gēnu segmentiem signālsekvence (leader) 36 40 ½ no V gēniem katrā grupā ir nefunkcionāli (sekvencē ir kļūdas, kas neļauj veikt gēna transkripciju vai translāciju). Precīzs funkcionālo V gēnu skaits būs atšķirīgs katram indivīdam.

l vieglās ķēdes gēni ► Katram C gēnam ir savs J (joining) gēns ► Satur 7 Cl gēnus ► Katram C gēnam ir savs J (joining) gēns ► 3 no 7 C-J klasteriem ir pseidogēni (satur STOP kodonus vai delēcijas, kas neļauj gēnam ekspresēties) ► Lielo klasteri no 70 V gēnu segmentiem 30 – 35 Vl gēni r pseidogēni

Smagās (H) ķēdes gēni Ca2 V1 V2 V130 J 1- 6 Cm Cd Cg3 Cg1 ye Ca1 Cg2 D 1-35 Cg4 Ce ► Atšķirībā no vieglajām ķēdēm, nāk klāt papildus D (diversity) rajons, kas atrodas starp V un J klasteriem. Sastāv no 3 gēnu klasteriem : V, D un J. ► Ir aptuveni 130 VH gēni, no kuriem tikai 45 ir funkcionāli

Kodē Ig smagās ķēdes dažādas klases un subklases Smagās (H) ķēdes gēni Ca2 V1 V2 V129 J 1- 6 Cm Cd Cg3 Cg1 ye Ca1 Cg2 D 1-35 Cg4 Ce ► Satur 9 funkcionālus CH gēnus: m, d, g1, g2, g3, g4, a1,a2 un e. Kodē Ig smagās ķēdes dažādas klases un subklases IgM IgD IgG1-4 IgA1-2 IgE

Smagās (H) ķēdes gēni Katrs CH gēns sastāv no 5 vai 6 eksoniem. Ca2 V1 V2 V129 J 1- 6 Cm Cd Cg3 Cg1 ye Ca1 Cg2 D 1-35 Cg4 Ce Katrs CH gēns sastāv no 5 vai 6 eksoniem. Kodē Ig smagās ķēdes konstanto daļu Šūnas membrānai piesaistītiem Ig kodē transmembrānas un citoplazmas domēnus.

TCR gēnu lokusa struktūra TCR a(+d), b un g ķēžu gēni atrodas 3 atsevišķos lokusos. Katram TCR lokusam ir V, J, un C segmenti TCR b un d lokusiem papildus ir D segments Katram TCR C gēnam ir sava J segmentu grupa Katrs C gēns sastāv no 4 eksoniem, kuri kodē TCR ekstracelulāro rajonu, īso eņģes, transmembrānas un citoplazmisko rajonus.

BCR gēnu pārkārtošanās ▶ notiek kaulu smadzenēs ▶ ir neatkarīga no antigēna Pārkārtošanās rezultātā nejauši izvelētie V, (D), un J gēnu segmenti tiek savienoti kopā. Tāpēc šo procesu sauc arī par V(D)J rekombināciju.

Kā tiek veidotas imunoglobulīnu vieglās un smagās ķēdes? Pirmkārt, vieglajai vai smagajai ķēdei tiek izveidots variablais domēns. Variablais domēns tiek izveidots gēnu somatiskās rekombinācijas procesā, kuru arī sauc par gēnu pārkārtošanos. Pēc variablā domēna izveidošanās, pie tā tiek pievienots konstantais domēns.

Vieglās ķēdes veidošanās Ck V1 V2 V40 C J 1 2 3 4 5 Ck J 3 4 5 V2 V40 1 2 V- J rekombinācija V1 C V1 3 4 5 Ck pārkārtotā DNS

J Ck V1 3 4 5 RNS splaisings Endoplazmatiskais tīkls mRNA V1 J3 Ck Signālsekvences eksons – kodē translētā proteīna 20-30 aminoskābes N-galā. Šīs aminoskābes veido signālpeptīdu. Signālpeptīds translācijas laikā virza polipeptīda ķēdi uz endoplazmatisko tīklu. Signālpeptīds tiek atšķelts no polipeptīda N-gala endosomās.

Smagās (H) ķēdes veidošanās Cm Cd Cg3 Cg1 ye J 1- 6 Ca1 Ce Ca2 Cg2 Cg4 1-35 V1 V2 V129 J Cm D 1-3 6 1 2 3 D-J rekombinācija: D3 J4 4 5 V1 V2 V129 J Cm D 1 2 DJ 5 6 pārkārtotā DNS

V-DJ rekombinācija: V1 D3J4 pārkārtotā DNS V1 V2 V129 J Cm D 1 DJ 5 6

Ig vieglā ķēde tiek savienota ar Ig smago ķēdi endoplasmatiskā tīklā. J Cm DJ 5 6 RNS procesēšana V1 Cm DJ mRNS Endoplazmatiskais tīkls Ig vieglā ķēde tiek savienota ar Ig smago ķēdi endoplasmatiskā tīklā.

Pārkārtoti imunoglobulīna gēni ▶Ig vieglās ķēdes (l vai k) V rajonu kodē V un J gēnu segmenti. ▶Ig smagās ķēdes V rajonu kodē V, D, J gēnu segmenti. ▶ Ig vieglās ķēdes C rajonu kodē 1 C eksons. ▶ Ig smagās ķēdes C rajonu kodē 5-6 eksoni.

Pārkārtoti TCR a b gēni

Ig un TCR gēnu rekombinācijas D + J = DJ d g 2.rekombinācija V + J = VJ V + DJ = VDJ VJ + C = VJC VDJ + C = VDJC

BCR V(D)J rekombinācijai ir nepieciešami: Ck J1-5 V1 V40 V2 V36 ▶ Imunoglobulīnu gēni ▶ Rekombinācijas SignālSekvences (RSS) ▶ Rekombināciju Aktivējošie Gēni RAG1 RAG2

RSS sastāv no Rekombinācijas signālsekvences (RSSs) 12 bp nanomērs CACAGTG ACAAAAACC heptamērs nanomērs 23 bp V1 CACAGTG ACAAAAACC RSS sastāv no konservatīva heptamēra precīzi 12 vai 23 nukleotīdu variablā speisera konservatīva AT-bagāta nonamēra RSS atrodas blakus katram Ig vai TCR gēna segmentam

V(D)J rekombinācijas mehānisms Rekombinācijas signālsekvences (RSSs) RSS sastāv no konservatīva heptamēra precīzi 12 vai 23 nukleotīdu variablo speiseri konservatīvu AT-bagātu nonamēru posmu Ar speisera palīdzību 2 heptamēri tiek novietoti pozīcijā, kura kļūst pieejama Rag-1 un Rag-2 enzīmiem. V(D)J rekombināze Tiek aizvākta no hromosomas Saglabājās hromosomā 50% no rekombinācijas Ig k lokusā Lielāka daļa no Ig rekombinācijas

12/23 likums V(D)J rekombinācijas mehānisms Rekombinācija starp diviem gēnu segmentiem notiek tikai tādā gadījumā, ja viena gēna galā atrodas 12 nukleotīdu speiseris, bet otrā gēna galā atrodas 23 nukleotīdu speiseris. Ig smagā ķēdē abiem V un J gēnu segmentiem galos atrodas 23 nukleotīdu speiseri. V un J gēnu segmenti nevar savā starpā rekombinēties. D gēnu segmentiem abos galos atrodas 12 nukleotīdu speiseri. Pirmā notiek D-J rekombinācija, kurai seko V-DJ rekombinācija.

RAG proteīni V(D)J rekombināze = Recombination Activating Gene RAG1 RAG 1 un RAG 2 ir kodola proteīni Limfocītā ir up 1000 kopiju RAG proteīnu RAGi ir vitāli svarīgi organismam Pele, kurai ir izslēgti RAG1 un RAG2 nespēj producēt Ig un veidot nobriedušos B un T limfocītus. Cilvēkam mutācijas RAG proteīnā izraisa akūto imūnsistēmas nepietiekamību (Omenn sindromu), kura ir letāla, ja netiek pārstādītas kaulu smadzenes.

ZnA Core region NBD ZnB Core region PHD Šķeļ DNS RAG1 1040aa ZnA Core region NBD ZnB Piesaista heptamēru E3 ubikvitīna ligāze Nonamēra piesaistes domēns Mijiedarbība ar histonu 3 Mijiedarbība ar RAG2 RAG2 527aa Core region PHD Svarīgs DNS šķelšanai Piesaista trimetilētu histonu (H3K4me3) Pastiprina DNS piesaisti Pastiprina RAG katalītisko aktivitāti Zn- Cinka pirksta rajons PHD- augu homeodomēns

RAG1 RAG1 spēlē lomu piesaistē pie RSS un DNS šķelšanā. RAG2 RAG2 mijiedarbojās ar RAG1, pastiprina RSS piesaistes specifiskumu un afinitāti, ir nepieciešams DNS šķelšanai. Nav DNS piesaistes aktivitātes. PHD domēns pastiprina RAG kompleksa katalītisko aktivitāti un novirza RAG2 uz aktīvā hromatīna rajoniem.

V(D)J rekombinācija RAG1/RAG2 veido tetramēru J V J RAG atkarīgā fāze V nehomologā DNS galu savienošanas fāze J V J V J V J DNS-atkarīgā proteīna kināze ir dubultpavediena DNS labošanas enzīms. DNS-PK fosforilē un aktivē endonukleāzi – Artemis, kura atver cilpas.

V(D)J rekombinācija tiek iedalīta 4 etapos: 1. 2 nejauši atlasītie gēnu segmenti un to RSS tiek pietuvināti viens otram. 2. V(D)J rekombināze veido pārrāvumus RSS un gēna sekvences savienojuma vietā. 3. Pārrāvumu vietas tiek modificētas. Tajās tiek pievienoti vai noņemti nukleotīdi. 4. Pārrautie kodējošie gali tiek saligēti.

V(D)J rekombinācijas iniciācija tiek regulēta 3 dažādos līmeņos. RAG proteīnu ekspresija augstā līmenī tiek palaista tikai limfocīta agrākajās attīstības stadijās. Tas nodrošina to, ka rekombinācija nenotiek citās šūnās. RAG proteīnu spēja uzsākt rekombināciju ir atkarīga no RSS pieejamības hromatīnā. Rekombinācija tiek regulēta ar Ig lokusa pozīciju un 3D arhitektūru kodolā. Hromosomas kondensācija un looping ļauj rekombinēt gēnus, kas atrodas tālu viens no otra. Rekombinācijas rezultātā tiek deletēts vai invertēts hromosomas DNS segments, kas var būt no pāris simtiem līdz dažu miljonu bp.

BCR (Ig) gēnu ekspresijas secība (alēļu izslēgšana) Smagās (H) ķēdes gēnu pārkārtošanās V-DJ rekombinācija pirmajā hromosomā D-J rekombinācija abās hromosomās V-DJ rekombinācija otrajā hromosomā B-šūnas apoptoze

Vieglās (L) ķēdes gēnu pārkārtošanās tiek pārtraukta IgM Šūna ekspresē m:k k vieglās ķēdes gēnu pārkārtošanās 1.hromosomā k vieglās ķēdes gēnu pārkārtošanās 2.hromosomā IgM Šūna ekspresē m:l l vieglās ķēdes gēnu pārkārtošanās 1.hromosomā l vieglās ķēdes gēnu pārkārtošanās 2.hromosomā B-šūnas apoptoze

TCR gēnu ekspresijas secība un ķēdes pārkārtojās gandrīz vienlaicīgi g b d g ja γ veiksmīgi tad pārkārtojās d ķēde ja γ veiksmīgi tad pārtrauc pārkārtošanos un izveidojās gd TCR d ja g vai d NEveiksmīgi tad turpina pārkārtoties b ķēde un iesāk α ķēde. ja veiksmīgi tad izveidojās ab TCR Dažreiz α ķēde var pārkārtoties abās hromosomās.

Kā veidojās Ig dažādība? Cilvēka organisms spēj producēt vairāk nekā 1012 dažādu Ig molekulu. 20-30000 1012 >> Kā cilvēks spēj producēt vairāk Ig (proteīnu) nekā gēnu skaits visā genomā?

Kā veidojās antivielu dažādība? ▶ Kombinatorā dažādība (V-(D)-J rekombinācija) ▶ Vieglās un smagās ķēdes kombinatorā asociācija ▶ Savienojuma dažādība (junctional diversity) ▶ Somatiskās hipermutācijas

V-J un V-D-J rekombināciju. Kombinatorā dažādība 1. Liels V, J un D gēnu skaits V1 V2 V129 D 1-35 Cm Cd Cg3 Cg1 ye Ca1 Ce Ca2 J 1- 6 Cg2 Cg4 2. Dažādība tiek palielināta ar V-J un V-D-J rekombināciju.

Kombinatorā dažādība 2.3 X 107 27300 870 Specifiskās antivielas VH VL ≈130 D 35 J 6 380 490 V ≈76 J 5 V ≈70 J 7 k l

Savienojuma dažādība Nukleotīdu pievienošana vai deletēšana V un J vai V, D un J gēnu segmentu savienošana veidojot eksonu nav precīza. Nukleotīdu pievienošana vai deletēšana Palielinās dažādība Ig 3.hipervariablajā cilpā

Savienojuma dažādības mehānisms

Savienojuma dažādības mehānisms Terminālā dezoksinukleotīdil transferāze (TdT)

Ig un TCR dažādība

TCR gēnu rekombinācijas mehānisms ir līdzīgs BCR (Ig) gēnu rekombinācijai V(D)J rekombinācijas sistēma darbojās abās T un B šūnās Izmanto tos pašus RAG1 un RAG2 enzīmus bet B-šūnās notiek tikai Ig gēnu rekombinācija T-šūnās notiek tikai TCR gēnu rekombinācija pateicoties dažādām rekombinācijas regulācijas sistēmām