Nešpecifická humorálna imunita Imunológia - 1. blok

Bunky imunitného systému bunky myeloidného radu – monocyty/makrofágy - granulocyty: bazofily (hematoxylín – modro) : eozinofily (eozín – červeno) : neutrofily

Mononukleárovo-fagocytový systém monocyty sú nezrelé => MAKROFÁGY v tkanivách HISTIOCYTY (spojivové) KUPPFEROVE BUNKY (v sínusoidoch pečene) OSTEOKLASTY (kosti) MIKROGLIÁ (mozog) ALVEOLOVÉ MAKROFÁGY (pľúca)

dendritové bunky – podľa lokalizácie: Langerhansove b. : intersticiálne d. b. : interdigitálne d. b. : cirkulujúce d. b. lymfocyty – B - T (Th, Tc/s) - NK

IMUNITA – NEŠPECIFICKÁ (zložky komplementu, faktory zrážania, proteíny akútnej fázy zápalu,...) - ŠPECIFICKÁ imunologická pamäť aktívna a pasívna imunita

Orgány IS Systémový IS: TÝMUS LYMFATICKÉ UZLINY SLEZINA KOSTNÁ DREŇ

TÝMUS

Lymfatické uzliny

Slezina

Slizničný IS = MALT (mucosa associated lymphatic tissue) a.) BALT (lymfatické tkanivo priedušiek) b.) GALT (lymfatické tkanivo čreva) c.) NALT (lymfatické tkanivo nazofaryngu) d.) lymfatické tkanivo v submukóze slizníc a exkrečných žľazách

3 typy lymfatického tkaniva: Peyerove plaky + M-bunky v tenkom čreve B-lymfocyty v lamina propria mucosae intraepitelové lymfocyty (väčšinou T-lymfocyty)

KOMPLEMENT systém viac než 30 glykoproteínov v sére, v telových tekutinách a na povrchu niektorých buniek syntetizujú sa v neaktívnom stave (okrem faktora D) aktivácia tromi cestami – KLASICKÁ - ALTERATÍVNA - LEKTÍNOVÁ

Klasická cesta: väzba antigén(Ag)-protilátka(Ab) alebo Ag-pentraxín (CRP, sérový amyloid P) C1 štiepi C4 a C2 na: C4a a C4b : C2b a C2a ↓ ↓ malé a veľké fragmenty C4bC2a = C3-konvertáza (štiepi C3 na C3a, C3b) C4bC2aC3b = C5-konvertáza (štiepi C5 na C5b, C5a)

Alternatívna cesta: samovoľné štiepenie C3, C3b sa viaže na povrch častice (mikroorganizmy,...) C3bBb = alternatívna C3-konvertáza C3b slúžia ako opsonín C3bBbC3b = alternatívna C5-konvertáza vznikom C5b začína terminálna (lýtická) fáza komplementovej kaskády

Lektínová cesta: iniciovaná sérovým lektínom => „lektín viažuci manózu“ (MBL) MBL sa viaže na sacharidové štruktúry povrchov niektorých mikróbov priamo. Jeho štruktúra je podobná C1 – tiež štiepi C4 a C2.

Biologické funkcie komplementu: lýza buniek, baktérií a vírusov s obalom opsonizácia zápal solubilizácia a clearance (odstránenie) imunokomplexov

Indikácie vyšetrenia komplementu pri ochoreniach, kde sa uplatňuje reakcia Ag+Ab, pričom sa ↓ jeho hladina v dôsledku jeho väzby na imunokomplexy (SLE, sérová choroba, subakútna bakteriálna endokarditída) pri membránoproliferačnej glomerulonefritíde pri chorobách pečene pri ochoreniach združených s vrodenými defektami zložiek komplementu (hereditárny angioedém, vaskulitídy,...) pri akútnych zápalových stavoch

Deficity komplementu: PRIMÁRNE SEKUNDÁRNE

Stanovenie komplementu aktivovaného klasickou cestou RADIÁLNOU HEMOLÝZOU: Princíp: Komplement (C) je aktivovaný hemolytickým systémom (HS), ktorý pozostáva z ovčích erytrocytov (OERY), na ktoré je nadviazaná protilátka (amboceptor – Am). Aktivovaný C spôsobuje lýzu OERY-Am, ktorá je závislá na množstve C.

Postup: Do agarózy s HS vykrojíme 5 jamôk, napipetujeme 5 μl vzorky a sér (o konc. 100%, 75%, 50%, 25%). Inkubujeme 20 hod. pri 4 °C vo vlhkej komôrke. Zmeriame zónu prejasnenia (mm). Zhotovíme kalibračnú krivku. Odčítame množstvo C . Referenčné hodnoty: 100 ± 13%

Titrácia komplementu aktivovaného klasickou cestou – určenie CH50: Princíp: ako predchádzajúci : stanovenie spektrofotometricky : Každá vzorka je v presných riedeniach, čím sa dosa- huje postupne klesajúca koncentrácia C. Z hodnôt hemolýzy sa vypočíta množstvo C (v hemolytických jednotkách). Hemolytická jednotka je množstvo séra, ktoré spôsobí lýzu 50% OERY-Am. Ref. hodnoty: 37,5 ± 4 CH50/ml neriedeného séra

Postup: 1. Nariedenie vyšetrovaného séra (sérum, VFR – vero- nalový fyziologický pufer). 2. Pridanie HS. 3. Inkubácia a odčítanie. Štandardný test poskytuje cenný výsledok o presnom množstve C – dôležité najmä u imunodeficientných pacientov.

LYZOZÝM zásaditá bielkovina IS hydrolytický enzým (muramidáza), ktorý štiepi β-1,4-glykozi- dovú väzbu spájajúcu N-acetylglukozamín a kys. murámovú v bunkovej stene baktérií stálý pri kyslom pH, nestálý pri alkalickom pH

Stanovenie lyzozýmu – fotometrická metóda: Princíp: Porušením bunkových stien a deštrukciou bakte- riálnych buniek pôsobením lyzozýmu dochádza k zníženiu zákalu bakteriálnej suspenzie, ktoré je úmerné množstvu lyzozýmu vo vyšetrovanej vzorke. Meria sa fotometricky. Súčasťou testu je je kalibračná krivka. Priemerné hodnoty lyzozýmu v sére sú 17,9 ± 3,9 mg/l. Pri fotometrickom stanovení sa používajú baktérie Micrococcus lysodeikticus.

Postup: 1. Do 96-jamkovej platne napipetujeme 50 μl vzorky a štandardy. Ako kontrolu pipetujeme 200 μl fosfá- tového pufru (pH = 6,2). 2. Do všetkých jamiek okrem kontroly pridáme 150 μl suspenzie M. lysodeikticus. 3. Premiešame a zmeráme zákal A0 (t = 0 minút, λ = 450 nm). 4. Inkubujeme 10 min. pri 25 °C. 5. Premiešame a zmeráme zákal A10 (t = 10 min.). 6. Vypočítame A10 – A0, zostrojíme kalibračnú krivku a odčítame koncentráciu lyzozýmu vo vzorkách.

FAGOCYTÓZA proces pohltenia a rozloženia veľkých partikúl Fázy: chemotaxia – migrácia (IL-1, IL-8, TNF-α, produkty baktérií) opsonizácia (IgG1, IgG3, C3b,...) adhézia ingescia (pohltenie) respiračné cídia (usmrtenie) vzplanutie degradácia

Metóda: fixovaný krvný náter Postup: 1. 2 ml venóznej krvi odoberieme do 10 j. heparínu a pridáme 200 μl suspenzie kvasiniek (ς = 2,5x106/ml). 2. Inkubujeme 1 hod. pri 37 °C – každých 20 min. jemne premiešať. 3. Urobíme nátery a vysušíme ich. 4. Farbíme roztokom May-Grünwald. 5. Hodnotíme imerzným objektívom (100x).

Hodnotenie: Hodnotíme 100 neutrofilných leukocytov. Vypočítame fagocytárnu aktivitu (FA) a fagocytárny index (FI). FA = Σ počet neutrofilov, ktoré pohltili aspoň 1 kvasinku/ Σ počet všetkých hodnotených neutrofilov Normálne hodnoty FA sú nad 30%.

FI = Σ počet pohltených kvasiniek/ Σ počet polymorfonukleárov, ktoré pohltili aspoň 1 kvasinku Normálne hodnoty FI sú 2,52 ± 0,4 %. Hodnoty sú platné pre normálny počet leukocytov, t.j. 5-10x109/l.

Fluorescenčná mikrometóda hodnotenia fagocytózy: Príprava vrstvy adherovaných PMNL na krycom sklíčku. Príprava suspenzie kvasiniek. Opsonizácia kvasiniek – inkubovať 15 – 20 min. s čerstvým humánnym sérom. Scentrifugovať a pridať Hanksov roztok a akridínovú zriedenú oranž. Vykonanie testu – na krycie sklíčko s PNML pridať suspenziu opsonizovaných kvasiniek. Inkubovať 45 min. v termostate pri 37 °C. Farbenie preparátu – 45 sekúnd roztokom akridínovej oranže.

Hodnotenie testu vo fluorescenčnom mikroskope pri 1000-násobnom zväčšení. Usmrtené kvasinky sú sfarbené do červena, živé do zelena, resp. do oranžova. Určiť FA a FI.

Fagocytóza

Poruchy fagocytózy chronická granulomatózna choroba = CGD (cídia) syndróm LAD = leukocyte adhesion deficiency (adhézia) deficiencia glukózo-6-fosfát dehydrogenázy = G6PD (cídia) deficiencia MPO = myeloperoxidázy (cídia) deficiencia sekundárnych granúl (cídia) deficiencia tuftsínu syndróm lenivých leukocytov (migrácia)

Cídna aktivita (CA): CA = pohltené mŕtve kandidy/všetky pohltené kandidy x 100 Fagocytóza (FA, FI) sa dá vyhodnotiť aj prietokovým cyto- metrom – namiesto kandíd sa použijú napr. E. coli. - použitie komerčných setov a hodnotenie PC-programom

Ďakujem za pozornosť