Centrifugēšana Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā MSc. biol. Aija Ozola aija.ozola@biomed.lu.lv

Kas ir centrifugēšana? Metode, ko izmanto, lai atdalītu pēc izmēra/ formas/blīvuma atšķirīgas vielas daļiņas, kas suspendētas šķidrumā centrifugēšana

Kas ir centrifugēšana? Centrifugēšanu izmanto, lai nogulsnētu, atdalītu, izolētu: Šūnas, baktērijas, vīrusus Šūnu organellas Makromolekulas (proteīnus, nukleīnskābes) Centrifugēšanu lieto, kad materiālu nevar filtrēt, piemēram, ja tas satur daudz blīvu sastāvdaļu (šūnu, šūnu atlieku)

Centrifugēšanas fizikālie principi Sedimentācija - daļiņas nosēšanās ārēja spēka ietekmē Kādi ārējie spēki ietekmē daļiņu? Zemes gravitācijas spēka lauks Centrifugālā spēka lauks

Stoksa likums Apraksta sfēriskas daļiņas gravitāciju, kur uz daļiņu iedarbojas 3 spēki: Fg - gravitācijas spēks Fb - peldspēja Fd - šķidruma viskozitātes radīts spēks Daļiņa sedimentēsies ar konstantu ātrumu, kad Fg = Fb + Fd

Stoksa likums Ātrums, ar kādu daļiņa sedimentēsies būs: d d šķ g η v sfēriskās daļiņas diametrs daļiņas blīvums šķīduma blīvums daļiņai pieliktais paātrinājums (980 cm/s2) šķīduma viskozitāte sedimentācijas ātrums Ātrums, ar kādu daļiņa sedimentēsies būs:

Stoksa likums Secinājumi: Sedimentācija ir proporcionāla: daļiņas lielumam daļiņas un šķīdumu blīvuma starpībai Sedimentācija nenotiek, kad daļiņas blīvums ir vienāds ar šķīduma blīvumu Sedimentācijas ātrums samazinās, palielinoties šķīduma viskozitātei Sedimentācijas ātrums palielinās, palielinoties g

Centrifugēšana Daļiņas sedimentācija centrifugālā spēka laukā ω r Fc ω centrifugālā spēka lauks rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass r

Stoksa likums centrifugēšanā Sedimentācijas ātrums: gravitācijas ietekmē centrifūgā

Relatīvais centrifugālais spēks (RCF) Praksē pielieto: Rāda, cik reizes lielāks spēks centrifūgas rotorā iedarbojas uz daļiņu, salīdzinot ar gravitācijas spēku (piemēram, 4000 x g) RCF ω r g relatīvais centrifugālais spēks rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass gravitācijas paātrinājums 980 m/s2

Rotora griešanās ātrums Praksē rotora griešanās ātrumu mēra apgriezienos minūtē revolutions per minute (rpm) ω rpm rotācijas ātrums apgriezieni minūtē

RCF un rpm sakarība Ja un tad RCF ω r rpm relatīvais centrifugālais spēks rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass apgriezieni minūtē

RCF ↔ rpm: nomogrammas Zinot centrifūgas rotora rādiusu, RCF (g) iespējams pārvērst par rpm un otrādi http://aquaticpath.umd.edu/nomogram.html

RCF ↔ rpm: online kalkulatori http://insilico.ehu.es/mini_tools/rcf_rpm.php

Sedimentācijas koeficients Raksturo daļiņas sedimentāciju centrifugējot Atkarīgs no daļiņas: lieluma blīvuma formas (kompaktuma) S v ω r d d šķ η sedimentācijas koeficients sedimentācijas ātrums rotācijas ātrums attālums no rotācijas ass daļiņas diametrs daļiņas blīvums šķīduma blīvums Šķīduma viskozitāte

Sedimentācijas konstante Lai sedimentācijas koeficents būtu konstante, sedimentācijas koeficentu nosaka ūdenī 20°C Bioloģiskām makromolekulām

Svedbergs (S) Sedimentācijas konstantes mērvienība Raksturo, ar kādu ātrumu daļiņa nogulsnēsies ultracentrifūgā Theodor H. E. Svedberg (1884 – 1971) 1926 (ķīmijā)

Sedimentācijas konstantes bioloģijā Eikariotu šūnas 100 000S Šūnu kodoli 50 000S Lizosomas 9400S Ribosomas (eikariotu) 80S (60S + 40S) Ribosomas (prokariotu) 70S (50S +30S) Nukleīnskābes 4-100S Proteīni 2-20S

Sedimentācijas konstantes bioloģijā Eikariotu šūnas 100 000S Šūnu kodoli 50 000S Lizosomas 9400S Ribosomas (eikariotu) 80S (60S + 40S) Ribosomas (prokariotu) 70S (50S +30S) Nukleīnskābes 4-100S Proteīni 2-20S

Sedimentācijas konstantes bioloģijā Koolman & Rohm. 2004. Color Atlas of Biochemistry.

Peldošais blīvums DNS peldošais blīvums g/cm3 Aprēķināts pēc ķīmiskā sastāva 2 Koncentrētā CsCl 1,7 Ūdenī 1,1 Šūnu organellu peldošie blīvumi saharozes gradientā: Goldži komplekss 1,06 – 1,10 Plazmas membrāna 1,16 Mitohondriji 1,19 Lizosomas 1,21 Ribosomas 1,40 Šķīstošie proteīni 1,30

Centrifugēšanas veidi Diferenciālā centrifugēšana Centrifugēšana blīvuma gradientā Zonālā Izopikniskā

1. Diferenciālā centrifugēšana Metode, ar kuru vienkārši nogulsnēt šūnas un to sastāvdaļas, kas izdalītas no homogenāta Pēc lieluma, blīvuma un/vai formas atšķirīgas daļiņas sedimentējas ar dažādu ātrumu Problēmas: kontaminācija (starp lielākām daļiņām atrodamas arī mazākas) grūti atšķirt daļiņas ar līdzīgām īpašībām

Homogenizēšana Process, kurā noārda audus, šūnu membrānas un atbrīvo šūnas saturu, iegūstot homogenātu Empīriska metode homogenizators

Homogenizēšanas metodes Fizikālas (lieto visbiežāk): Berzes spēks Hidrodinamisko spēks Prese Ultraskaņa Sasaldēšana /atkausēšana Osmotiskais šoks Ķīmiskās: apstrāde ar enzīmiem homogenizators

1. Diferenciālā centrifugēšana

2. Centrifugēšana blīvuma gradientā a) Zonālā b) Izopikniskā Gradients tiek pagatavots pirms centrifugēšanas Gradienta koncentrācija ir neliela, rpm mazāk Paraugs tiek uznests gradienta augšpusē Balstās uz daļiņu lielumu un masu Gradients veidojas centrifugēšanas procesā Gradienta koncentrācija ir augsta, rpm vairāk Paraugs tiek sajaukts ar centrifugēšanas vidi Balstās uz daļiņu blīvumu

2. Centrifugēšana blīvuma gradientā a) Zonālā b) Izopikniskā Gradientam jābūt pietiekami garam, lai daļiņas atdalītos Svarīgi nepārsniegt centrifugēšanas ilgumu Gradienta garumam nav tik liela nozīme Centrifugēšanas laikam jābūt pietiekami garam, lai daļiņas nonāktu līdz to izopikniskajam punktam. Ilgāks centrifugēšanas laiks rezultātu neietekmē

2. Centrifugēšana blīvuma gradientā a) Zonālā b) Izopikniskā Koolman & Rohm. 2004. Color Atlas of Biochemistry.

Vides centrifugēšanai blīvuma gradientā Gradients Šūnas Vīrusi organellas Nukleo- proteīni Makro- molekulas Cukuri (saharoze) + +++ - Polisaharīdi (fikols) ++ Koloidālais silīcija oksīds (perkols) Jodizētās vides (nikodenzs) ++++ Sārmu metālu sāļi (CsCl) ++++ ļoti labs, +++ labs, ++ labs atsevišķos gadījumos, + ierobežota lietošana, - nepielieto

Centrifūgu tipi Laboratorijas Ātrgaitas Ultra- Maksimālais ātrums (rpm) 10 x 103 28 x 103 100/500 x 103 Maksimālais RCF 7 x 103 100 x 103 800/900 x 103 Izmantošana izolēšanā Baktērijas Jā (Jā) Dzīvnieku un augu šūnas Kodoli Nogulsnēšana Dažreiz Galvenokārt Membrānas Ribosomas/polisomas - Makromolekulas Vīrusi ( ) – var izmantot, bet parasti nelieto

Ultracentrifūgas uzbūve

Rotoru tipi Leņķa Vertikālie Horizontālie Gallagher SR, Centrifugation, DOI:  10.1002/9780470089941.et0501s00

Centrifugēšanas veidi Rotoru pielietojums Rotora tips Centrifugēšanas veidi Diferenciālā Zonālā Izopikniskā Leņķa Teicams Ierobežota izmantošana Labs makromolekulām, slikts šūnām un šūnas organelām Horizontālais Labs Labs šūnām un šūnas organelām, jāuzmanās lietojot CsCl gradientu Vertikālais Neder

Centrifūgas BMC Beckman Coulter ultracentrifūga Optima L-100 XP 100 000 rpm Izmaksas ≈ 80 000 Ls (114 000 €) centrifūga ≈ 40 000 Ls 4 rotori ≈ 40 000 Ls

Noteikumi strādājot ar centrifūgu Vienmēr jāsagaida, kad centrifūga sasniegusi maksimālo ātrumu un jāpārliecinās, ka tā normāli darbojas (nav aizdomīgu trokšņu vai vibrāciju) Strādājot ar lieliem apgriezieniem jāpārliecinās, ka izvēlēts pareizais rotors jāizvēlas pareizie stobriņi Centrifugēšanas stobriņiem jābūt līdzsvarā un tie jāizvieto simetriski!!!

Kā stobriņus pareizi izvietot? http://onfocuslaboratories.com/support/content/balancing-your-centrifuge

Kā stobriņus pareizi izvietot? Eppendrof manual

Kā stobriņus pareizi izvietot? Eppendrof manual

Praktiskais darbs Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā Mononukleāro šūnu (limofocītu) izdalīšana no asinīm. NB!!! Ar asinīm strādāt cimdos! Kodolu frakcijas iegūšana no audu šūnu kultūras 2.1. Šūnu iegūšana no audu šūnu kultūras suspensijas 2.2. Kodolu frakcijas iegūšana

Limfocītu izdalīšana fikola gradientā B - asinis F - fikols P - asins plazma, trombocīti W - limfocīti R - eritrocīti, granulocīti PIRMS PĒC http://hipc.stanford.edu/sops/pbmc-isolation-accuspin-conical-method