DNS, RNS un proteīnu biosintēze

Trīs galvenie procesi šūnā Replikācija (DNS-DNS) Transkripcija (DNS-RNS) Translācija (RNS-proteīni)

Kurš process ir visnepieciešamākais dzīvībai? Translācija ? Transkripcija ? Replikācija ? DNS RNS Proteīni Informācijas plūsma Informācijas nesēja replikācija

Galvenās atšķirības starp eikariotu un prokariotu šūnām Eikariotos kodolam un citām organellām ir sava membrāna Prokariotiem nav citoskeleta Genoma organizācija ir ļoti atšķirīga Vērojamas lielas atšķirības bioķīmiskajos procesos, replikācijā, transkripcijā un translācijā

Kas notiek replikācijā? 1. DNS dubultspirāle atritinās 2. Pēc komplementaritātes principa uz abiem esošajiem DNS pavedieniem veidojas jauni

Replikācijas ķīmija 5' gals H20 + + Saites veidošanās 3' gals OH O P CH2 Base CH2 Base O O OH O P OH O P CH2 Base CH2 Base O O H20 + OH P O OH OH O P 3' OH O P OH OH O P + Saites veidošanās CH2 OH O P O Base 5' CH2 Base O OH 3' 3' gals OH

Kas ir nepieciešams replikācijai ? 1) dsDNS 2) Oriģins – DNS rajons, kuru atpazīst replikācijas mašinērija 3) Replicējošie enzīmi 4) Nukleotīdi

Polimerāžu enzimātiskās aktivitātes 5’-3’ polimerāzes aktivitāte 5’-AAGTCACC-3’ 5’-AAGTCACCG-3’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ NEKAD nav 3’-5’ polimerāzes aktivitāte! +G 5’-3’ polimerāzes aktivitāte piemīt visām DNS un RNS polimerāzēm

Polimerāžu enzimātiskās aktivitātes 3’-5’ eksonukleāzes (editēšanas) aktivitāte 5’-AAGTCAC -3’ 5’-AAGTCAC-3’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ A -A Normālos apstākļos, tiek aizvākts viens nepareizi pievienots nukleotīds (t.i., izlabota kļūda) 3’-5’ eksonukleāzes aktivitāte piemīt lielākajai daļai (bet ne visām) DNS un RNS polimerāžu Dažām polimerāzēm piemīt arī 5’-3’ eksonukleāzes aktivitāte (piemēram, DNS polimerāzei I)

Polimerāzes un praimeri DNS polimerāzes spēj tikai pagarināt esošu DNS vai RNS fragmentu (praimeri), bet nespēj uzsākt fragmenta sintēzi RNS polimerāzēm ir nepieciešams tikai komplimentārais pavediens Tādēļ, replikācijas procesu uzsāk RNS polimerāze (t.i., uzsintezē praimeri), bet turpina DNS polimerāze

Praimeris Komplimentārais pavediens (matrica)

DNS replikācija (E.coli) Pol III sintezē vadošo pavedienu 4 2 1 Helikāze atvij spirāli 3 Primāze sintezē RNS praimeri Topoizomerāze sašķeļ vienu DNS pavedienu, lai noņemtu mehānisko spriegumu Pol I aizvieto RNS praimeri ar DNS 5 6 7 SSB proteīni aizkavē dubultspirāles veidošanos Pol III pagarina praimeri, producē Okazaki fragmentu DNS ligāze savieno Okazaki fragmentus

DNS Replikācija (Eikarioti) RPA proteīni aizkavē dubultspirāles veidošanos Pol d sintezē vadošo pavedienu 5 2 1 Helikāze atvij spirāli Primāze sintezē RNS praimeri 3 4 Topizomerāze sašķeļ vienu DNS pavedienu, lai noņemtu mehānisko spriegumu RNāze H izšķeļ RNS praimeri Pol a nedaudz pagarina RNS praimeri 5 6 7 Pol d aizvieto Pol a; producē Okazaki fragmentu DNS ligāze savieno Okazaki fragmentus

Atšķirības eikariotu un prokariotu replikācijas dakšā Eikariotos RNS praimeri vispirms pagarina Pol α un tad Pol δ. Prokariotos praimeri pagarina tikai PolIII Eikariotos RNS praimeri izšķeļ RNāze, kamēr prokariotos – DNS PolI, kura vienlaicīgi arī aizpilda spraugu ar DNS Prokariotos Okazaki fragmenti ir aptuveni 2000 bp gari, bet eikariotos – aptuveni 200bp gari (nevis otrādi...)

Citas atšķirības eikariotu un prokariotu replikācijā Cēloņi: 1. Eikariotiskās hromosomas ir daudz garākas par prokariotiskajām 2. Eikariotiskās hromosomas ir lineāras, nevis cirkulāras 3. Eikariotiskās hromosomas ir sapakotas un uztītas uz histoniem

Hromosomu multiplie oriģini Baktērijas Eikarioti

DNS sintēzes ātrumi un nepieciešamība pēc vairākiem oriģiniem Genoms Repl. ātrums Repl. laiks Oriģini Komentāri E. coli 4.6 Mbp 30 kb/min 40 min 1 1 l kultūrā = 4.1010 šūnu --> 400 000 km sintezētas DNS Raugs 14 Mbp (1 cm) 3 kb/min 20 min 330 Repl. ilgtu 80st ja būtu 1 ori Dzīves laikā (1016 šūnu dalīšanās) sintezēti 2x1013 km DNA (2 gaismas gadi) Cilvēks 3 Gbp (2 m) 3 kb/min 7 h >10 000 ? Repl. ilgtu 1 gadu, ja būtu 1 ori

Lineāras DNS replicēšanai vajag īpašus līdzekļus: Telomēras un telomerāze Telomēras: īsu sekvenču atkārtojumi hromosomu galos Telomerāze: polimerāze, kas veido telomēras Kam noder telomēras un telomerāze?

Telomerāze darbībā Telomerāze satur savu RNS fragmentu, kas darbojas kā matrica DNS galu sintēzei RNS fragments satur divus tiešos atkārtojumus (parādīts aaaacccc 2x atkārtojums dažos vienšūņos, mugurkaulniekiem tas ir cccctaa) Pēc viena nukleotīdu pievienošanas cikla, telomerāze translocējas līdz nākošajam ttttgggg atkārtojumam Realitātē process ir ievērojami komplicētāks...

Vai telomerāze vienmer ir aktīva? Aktīva bērniem un pieaugušo dzimumšūnās un cilmes šūnās Neaktīva lielā daļā somatisko šūnu pieaugušajiem Tātad hromosomas patiešām ar laiku paliek īsākas – viens no iemesliem, kāpēc mēs novecojam Tā paša iemesla dēļ kultivētas primārās zīdītāju šūnas dalās ierobežotu reižu skaitu Telomerāzes aktivācija pieaugušās pelēs paildzina to mūžu Telomerāze ir aktīva lielākajā daļā audzēju

Transkripcija

Kas ir nepieciešams transkripcijai? dsDNS matrica promoters = transkripcijas uzsākšanas vieta ribonukleotīdi RNS polimerāze un transkripcijas faktori

Eksoni, introni un sekvences gēnu galos Introni –nekodējošās sekvences eikariotu gēnu vidus daļā Eksoni – gēnu kodējošās sekvences Introni bieži tiek uzlūkoti kā “nederīga” DNS, bet tie var saturēt regulatoras sekvences vai funkcionālas nekodējošās RNS Parasti introni ir daudz garāki par eksoniem Gēnu 5’un 3’ gali satur t.s. netranslētos reģionus (UTR), kuri satur regulējošas sekvences Eksoni 5’ UTR (Untranslated region) 3’UTR Introni

Eikariotiskie promoteri TATA bokss Vislabāk izpētītā promoteru sekvence Atrodas daudzu, bet ne visu gēnu 5’ UTR sastāvā 25-35 nukleotīdus pirms transkripcijas sākuma vietas Piesaista t.s. TATA boksa piesaistīšanās proteīnu TBP, kas ir transkripcijas faktora TFIID sastāvdaļa

Citi eikariotisko promoteru elementi -100 līdz -1 -37 līdz -32 -31 līdz -26 -2 līdz +4 +28 līdz +32 CpG BRE TATA Inr DPE GGG CCA A T T A G A C A G AC TT CGCG TATA AA PyPyAN PyPy G CpG salas – CG bagātas sekvences, piedalās transkripcijas regulācijā, C nukleotīds var būt metilēts BRE (TFII B recognition element) – tieši piesaista transkripcijas faktoru IIB Iniciatora elements (Inr) darbojas līdzīgi TATA boksam un arī piesaista TBP DPE elements (Downstream promoter element) piesaista citas TFIID subvienības- TAF9 un TAF5 Eikariotisko promoteru sastāvā var būt viens vai vairāki no minētajiem elementiem

Enhānseri Transkripciju regulējošie elementi tālu (līdz 50,000 bp) no transkripcijas sākuma vietas Var atrasties pirms gēna, pēc gēna vai intronā Kalpo kā regulatoro proteīnu piesaistes vieta

Transkripcijas iniciācija eikariotos - pārskats Enhancer

Vispārējie transkripcijas faktori (GTFi, General transcription factors) Nepieciešami RNS polimerāzes piesaistei un transkripcijas uzsākšanai no lielākās daļas promoteru Prokariotos ir tikai viens GTF – sigma faktors Eikariotos ir vismaz 6 GTFi – TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF un TFIIH

GTFu funkcijas A (A) TFIID (kura sastāvdaļa ir TBP) atpazīst TATA boksu (B) TFIIA un B stabilizē kompleksu, rada vietu RNS polimerāzes piesaistei (C) TFIIF piesaista brīvu RNS polimerāzi un kopā ar TFIIE un H piesaistās esošajam kompleksam TFIIE un TFIIH ir iesaistīti dsDNS pavedienu atdalīšanā (D) Pēc visu faktoru un RNS polimerāzes piesasitīšanās sākas transkripcija Pēc transkripcijas uzsākšanas, GTFi no kompleksa disociē B C D

Transkripcijas trīs fāzes Start Stop Iniciācija Iniciācijā pie promotera piesaistas GTFi un RNS polimerāze un izveidojas transkripcijas burbulis Elongācijā notiek RNS ķēdes pagarināšana Terminācijā polimerāze sasniedz transkripcijas «stop» sekvenci (terminatoru) un RNS ir gatava movie Transkripcijas burbulis Elongācija DNS-RNS hibrīds Augošā RNS Terminācija

Pēc transkripcijas... Prokariotos RNS ir gatava translācijai uzreiz pēc transkripcijas vai pat vienlaicīgi ar to Eikariotos vispirms ir jāveic RNS procesēšana un transports uz citoplazmu

pre-mRNS procesēšana 1) Kepings 2) Poliadenilēšana 3) Splasings (1) (2) (3)

Keps (angl. cap) Īpaša struktūra mRNS 5’- galā 7-metil guanilāts Īpaša struktūra mRNS 5’- galā Nepieciešams translācijai eikariotos Pievieno kepinga enzīms un metiltransfreāzes Norisinās vienlaicīgi ar transkripciju Apzīmējums: m7Gppp 5’- 5’ saite ar 3 fosfātu grupām Pirmo 2 nukleotīdu metilēšana

Poliadenilēšana Gēnu 3’ galos ir t.s. poly-A signālsekvence: AAUAAA(N)50(G/U)bagāts rajons Sasniedzot poly-A signālu : 1. Transkripcija tiek terminēta 2. RNS tiek sašķelta 10-35 nukleotīdus pēc AAUAAA sekvences 3. Poly-A polimerāze pie RNS pievieno aptuveni 200 adenilātus Poliadenilēšana ir nepieciešama: 1) transkripcijas terminācijai 2) mRNS transportam uz citoplazmu 3) translācijai 4) mRNS aizsardzībai pret eksonukleāzēm

Splaisings: intronu izšķelšana Konsensus sekvence splaisa saita tuvumā YYYY

Splaisinga molekulārais mehānisms Splaisings notiek ar divu transesterifikācijas reakciju palīdzību Rezultātā izšķeļas «P» veida lariāta introns Reakciju katalizē splaisosoma – liels proteīnu un RNS komplekss

mRNS nukleārais transports Process, kurā mRNS tiek transportēta uz citoplazmu m7Gppp mRNS A AA mRNS eksporteris Nukleoplazma Kodola membrāna Nukleārā pora Citoplazma

Translācija

Ģenētiskais kods

Translācijas fāze Gēna sekvence: AGGTCATGTCTAGGTATGCCC 1. fāze: Arg Ser Cys Leu Gly Met Pro 2. fāze: A GGT CAT GTC TAG GTA TGC CC Gly His Val ---- Val Cys Pro 3. fāze: AG GTC ATG TCT AGG TAT GCC C Val Met Ser Arg Tyr Ala Vēl 3 fāzes ir uz otrā dsDNA pavediena

Trīs galvenie RNS veidi mRNS – translācijas matrica rRNS – ribosomu sastāvdaļa tRNS – nolasa mRNS kodu

tRNS tRNS satur atbilstošās aminoskābes antikodonu – t.i. kodonam komplimentāru sekvenci

Aminoacil-tRNS sintēze Augstas enerģijas estera saite Aminoskābe (Phe) Phe un tRNSPhe savienošana Phe aminoacil-tRNS sintetāze Phe tRNS (tRNSPhe) Aminoacil-tRNS

Ģenētiskā koda nolasīšanas mehānisms tRNSPhe saistās ar Phe kodonu UUU Kopējais rezultāts: Phe atpazīst savu kodonu Aminoacil-tRNS mRNS

Ribosoma Proteīnu biosintēzes mašinērija 65% RNS, 35% proteīns 4 dažādas RNS, 83 proteīni (eikariotiem) Katalītisko aktivitāti veic RNS daļa

Translācijas faktori Proteīni, kuri nav ribosomu sastāvā, bet kuri ir nepieciešami dažādos translācijas etapos – iniciācijā, elongācijā un terminācijā Iniciācijas faktori (eIF1, eIF2...) Elongācijas faktori (eEF1, eEF2) Atbrīvošanas (angl. «release») faktori (eRF1, eRF3), nepieciešami translācijas terminācijai

Eikariotiskās ribosomas subvienības eIF6 un eIF3 neļauj 60S un 40S subvienībām priekšlaicīgi apvienoties

Iniciācija Pirmās aminoacil tRNS piesaistīšana Preiniciācijas komplekss

Preiniciācijas komplekss mRNS piesasitīšana Iniciācijas komplekss

Iniciācijas komplekss mRNS skanēšana un starta kodona atpazīsana

Lielās subvienības piesaistīšana

Elongācija Ribosomā ir 3 centri (E, P, A), kuros var atrasties tRNS: A – Aminoacil-tRNS piesasitīšanās P – Peptīda E- tRNS izejas (Eject) Nākošās aminoskābes piesaistīšana A centrā

Peptīda saites izveidošana

Ribosomas translokācija

Terminācija Terminācijas kodonu neatpazīst tRNS, bet atbrīvošanas faktoru eRF1-eRF3 komplekss Rezultātā tiek atšķelta pēdējā tRNS P saitā un atbrīvota ribosoma un proteīns Movie

Ribosomas atkārtota izmantošana