Metabolism proteic I Proteine

Clasificarea proteinelor Holoproteine sferoproteine: globuline, albumine, histone scleroproteine: colagen, keratina, elastina Heteroproteine glicoproteine lipoproteine nucleoproteine

Rolul proteinelor Rol plastic Rol enzimatic Rol hormonal Rol imunitar Rol homeostatic - coagulare şi fibrinoliză, echilibru hidroelectrolitic, acido-bazic

Proteinele totale Valori normale: 6,5 – 8,5 g/dl Hiperproteinemia reală – aport alimentar proteic crescut, plasmocitoame, tumori secretante de paraproteine pseudohiperproteinemia – sindrom de hemoconcentrație (deshidratare) Hipoproteinemia reală – scăderea aportului, scăderea absorbției intestinale, scăderea sintezei interne, pierderi proteice, hipercatabolism proteic pseudohipoproteinemia – hiperhidratări, sdr. de hemodiluție

Metode de investigație a proteinelor plasmatice Condiţii de recoltare: Dimineaţa după repaus alimentar nocturn Recoltare fără stază (presiunea hidrostatică crescută în vas duce la extravazarea lichidului în interstiţiu şi apariţia hemoconcentraţiei) Fără hemoliză – se folosesc ace corespunzătoare Dacă se doreşte repetarea analizei, condiţiile la cea de-a doua recoltare trebuie să fie similare celor de la prima recoltare. Reacţia biuretului (valoare istorică) – cuprul bivalent se leagă de legăturile peptidice şi determină apariţia unei coloraţii albastre cuantificabilă spectrofotometric. Intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia proteinelor. Valori normale: 6,5 -8,5 g/l – proteine totale serice albumine/globuline=1,3 - 1,5 Valori fals crescute la valori mari ale bilirubinei (peste 5mg/dl), hemoglobinei şi trigliceridelor (peste 1000 mg /dl)

Separarea proteinelor plasmatice 1. Ultracentrifugare - în funcţie de constanta de sedimentare, prin variația forţei centrifuge.

Separarea proteinelor plasmatice 2. Electrodifuzie - analiză calitativă care se face în funcţie de sarcina electrică globală, de masa moleculară şi de pH-ul soluţiei Noțiuni: pH izoelectric al substanței - pH-ul soluţiei la care sarcina electrică globală a unei substanţe este 0 pHs > pHi → sarcină globală negativă pHs < pHi → sarcină globală pozitivă pHs pt proteinele serice este de 8,6 (>pHi) → proteinele sunt încărcate negativ → se vor deplasa spre catod cu o viteză D.P. cu masa moleculară Ordinea fracţiunilor proteice va fi dinspre A spre K – albumine, globuline, alfa1, alfa2, beta, gama.

Separarea proteinelor plasmatice Mediile de migrare: Gel : agar, agaroză, în care migrarea poate dura până la 24 ore Folii de acetat de celuloză şi poliacrilamidă – durează 2-3 ore Hârtii de filtru Placa obţinută se compară cu o placă standard, evaluând grosimea benzilor, intensitatea culorii benzii (la hârtiile de filtru) şi sediul migrării.

Separarea proteinelor plasmatice Un comportament normal la electroforeză = euproteinemie 6 - 8,5 g de proteine totale : Albumine : 50 – 60 % (3,5 – 5,5 g) Alfa 1 globuline : 3 - 4 % Alfa 2 globuline : 6 - 9 % Beta globuline : 10 - 12 % Gama globuline : 18 - 20 % Fibrinogenul : 200 – 450 mg/dl

Separarea proteinelor plasmatice 3. Imunodifuzia are la bază reacţiile de precipitare Ag-Ac in mediu solid sau lichid. Precipitarea în solid (difuzia în gel) este de 3 tipuri: Simplă – Ac e fix, Ag difuzează (IDRS / Mancini) Dublă – Ag migrează spre Ac şi Ac spre Ag Migrarea în câmp electric (imunoelectroforeză)

Separarea proteinelor plasmatice Difuzia simplă (imunodifuzia) – IDRS sau Mancini este o metodă sensibilă, putând detecta concentraţii de până la 2 μg/ml dezavantajul că necesită timp (1-3 zile pt difuzia completă) şi trebuie lucrată manual. Se utilizează pentru dozarea Ig sau a fracţiunilor C Este o reacţie semicantitativă. Metodă: Placa, cu gel de agaroză conține serul cu anticorpii (se știu cantitatea de ser şi concentraţia de anticorpi) Serul bolnavului se pune într-un godeu pe placa cu gel de agaroză. Datorită prezenței anticorpilor în gel și migrării Ag din serul pacientului, în jurul godeului apare un inel de precipitare al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia de antigen.

Separarea proteinelor plasmatice Difuzia simplă (imunodifuzia) – IDRS sau Mancini - rezultat

Separarea proteinelor plasmatice Imunoelectroforeza este o migrare în câmp electric combinat cu o reacţie imună antigen-anticorp (Ag-Ac) Metoda: Se realizează în două etape: placa se împarte în 2 – inferior ser normal şi superior ser de la bolnav, separate între ele printr-un şanţ . Se introduce în câmp electric si se separa antigenele prezente in seruri. Dupa aceasta in santul facut la inceput se adauga anticorpii. Antigenele vor migra catre anticorpi Fiecare arc de precipitare corespunde unei anumite proteine din complexul pe care îl căutăm Există rigle pe care sunt desenate arcurile de precipitare normale care se suprapun pe placă şi vedem dacă arcurile obţinute sunt normale sau patologice. Este si o reacţie calitativă ce are o durată de lucru mare : 24-72 de ore Se utilizează pentru confirmarea prezenţei unor proteine anormale – gamapatii monoclonale şi de asemenea pentru confirmarea absenţei unor proteine normale (afibrinogenemie, atransferinemie, abetalipoproteinemie). Avantaje: Determină clasa şi tipul de Ig în gamapatiile monoclonale Detectează proteinuria Bence-Jones Dezavantaje Nu detectează componentele monoclonale în cantităţi mici Nu detectează lanţurile uşoare ale IgM

Separarea proteinelor plasmatice Imunoelectroforeza – rezultat

Separarea proteinelor plasmatice 4. Electroforeza capilară Metodă intermediară între electroforeza clasică și cromatografia lichidă Principiu: moleculelor proteice poartă încărcături electrice diferite și sunt separate lor prin fluxul electroosmotic. Sistemul are 8 capilare ce funcționează în paralel realizând 8 analize simultan. Proba diluată cu tampon este preparată și injectată prin aspirație în zona anodică. La un voltaj mare separarea proteinelor va fi citită direct la 200 nm, în partea catodică a capilarului. Probele trebuie depozitate la o temperatură între 2 și 8 grade. În această perioadă valorile C3 și ale fracțiunii beta vor scade progresiv, vor apare mici fracțiuni în zona gamma și alfa2.

Separarea proteinelor plasmatice 5. Nefelometria Metoda cea mai folosită în prezent Funcţionează pe baza reacţiei Ag-Ac, unde Ag sunt considerate în acest caz proteinele plasmatice, iar Ac sunt reprezentați de Ac antiproteină umană. Există două submetode: Turbidimetria – apreciază concentraţia de Ag în funcţie de cantitatea de lumină captată de detectorul de transmisie Nefelometria propriu-zisă – apreciază câtă lumină e deviată şi captată de detectorul de difuzie. Ulterior se face corelaţia între cantitatea de lumină captată şi concentraţia Ag (respectiv a proteinelor) Metoda este rapidă, sensibilă, automatizată, dar este scumpă.

Separarea proteinelor plasmatice Zona albumine şi alfa1 gamaglobuline : Prealbumina; Albumina; Alfa1-antitripsina; Alfa1-glicoproteina acidă; Componente ale complementului (C5); Alfa-fetoproteina; Protrombina.

Separarea proteinelor plasmatice Zona alfa2: Haptoglobina; Ceruloplasmina; Alfa2 macroglobulina; Colinesteraza; Alfa2 antitrombina; Plasminogenul; Transcortina; Eritropoietina; Componentele C1,C4, C6,C9 ale complementului; Lipoproteine.

Separarea proteinelor plasmatice Zona beta : Beta2 microglobulina; Transferina; Imunoglobuline; Lizozim; Beta-lipoproteinele.

Separarea proteinelor plasmatice Zona gama: Proteina C reactivă Fibrinogenul Imunoglobuline

Imunoglobulinele Imunoglobulina A: 60-400 mg/dl Rol important in imunitatea mucoaselor (se secreta 3-5 g de IgA zilnic in lumenul intestinal), prevenind colonizarea cu agenti patogeni Prezent in secretiile digestive, genito-urinare, lacrimale, saliva, laptele matern, etc. Are 2 subclase IgA1 si IgA2, poate exista si in forma de dimer – IgA secretorie (rezistenta la actiunea enzimelor digestive) Valori crescute - de obicei policlonale: Mielom gama-A, ciroza hepatica (alcoolica), LES, PAR cu titluri inalte de FR, sarcoidoza Valori scazute: Izolate – teleangiectazia ereditara, disgamaglobulinemie tip III, malabsorbtie, CH, LES, macroglobulinemie Waldenstrom Policlonale – agamaglobulinemie, aplazie timica ereditara, disgamaglobulinemie tip I (scad IgG si IgA si cresc IgM), disgamaglobulinemie tip II (IgA si IgM absente, niveluri normale de IgG), la sugar si copii

Imunoglobulinele Imunoglobulina D 0-14 mg/dl Exprimata pe suprafata LB imature (nu au fost expuse la antigeni) alaturi de IgM sau regasita libera in ser ca monomer Rol in activarea LB, bazofilelor si mastocitelor Valori crescute – infectii acute/cronice acutizate, boli autoimune Valori scazute – deficite ereditare, imunodeficienta dobandita, mielom non IgD, la sugar si copil mic

Imunoglobulinele Imunoglobulina M 60-300 mg/dl Exprimata pe suprafata LB sau libera in ser Poate forma polimeri (2 pana la 6 IgM) – difuzeaza greu in interstitiu si nu traverseaza bariera placentara Primii Ac ce apar in cursul unei infectii, reaparand la expuneri ulterioare la acelasi germene Ex – aglutininele Implicati in reactiile de hipersensibilitate tip II si V – dupa clasificarea Coombs si Gell Valori crescute – afectiuni hepatice, infectii acute/cronice acutizate Valori scazute – hipoproteinemii, mielom nonIgM, nou nascut

Imunoglobulinele Imunoglobulina E 7-15 mg/dl Indica prezenta de afectiuni parazitare sau alergice Valori crescute – boli atopice, parazitoze Valori scazute - deficiente ereditare, imunodeficienta dobandita, sdr ataxie-teleangiectazie, mielom non IgE Valorile normale nu exclud aparitia simptomelor – crize astmatice cu nivel normal de IgE -Ag e recunoscut de Ig, cu activare secundara a mastocitelor, bazofilelor, degranularea acestora cu eliberare de mediatori proinflamatori – severitatea reactiei poate merge pana la instalarea starii de soc (soc anafilactic – reactie de hipersensibilitate tip I)

Imunoglobulinele Imunoglobulina G 700-1500 mg/dl Este produsa de LB Reprezinta aprox 75% din Ig serice Implicata in raspunsul imun secundar/tardiv Singurul izotip de Ig care poate trece prin placenta, conferind protectie imuna in utero (subclasele 1,3,4; subclasa 2 nu traverseaza placenta) e asociat cu reactiile de hipersensibilitate de tip II si III precum si afectiunile autoimune (tip V) Valori crescute: sarcoidoza, hepatite cronice, boli autoimune, parazitoze, infectii cronice Valori scazute: sdr cu pierdere de proteine, sarcina, mielomul non IgG, macroglobulinemia Waldenstrom

Modele proteice - Inflamația acută - Proteine totale normale sau ușor crescute; Albumine normale (Excepţie: inflamaţiilor acute din arsuri întinse când avem hipoalbuminemie); Alfa1 şi alfa2 globulinele sunt crescute, mai ales alfa2 – caracteristica reacţiei inflamatorii acute; Beta şi gama globulinele sunt normale; Fibrinogenul crescut; VSH-ul crescut; Prezenţa proteinei C reactive.

Modele proteice - Inflamația cronică - Proteine totale normale sau ușor crescute; Albumine normale (Excepţie: inflamaţiilor acute din arsuri întinse când avem hipoalbuminemie); Alfa1 şi alfa2 globulinele normale. Valorile crescute arată un episod de acutizare a afecțiunii cronice; Gama globulinele crescute; Fibrinogenul crescut; VSH-ul crescut; Prezenţa proteinei C reactive – valorile ei crescute nu sunt caracteristice.

Modele proteice - Sdr. nefrotic - Proteinele totale scăzute; Albuminele scăzute; alfa 1 globulinele normale (initial) sau scăzute (tardiv); alfa 2 globulinele şi beta globulinele pot fi normale sau crescute – creştere în bandă (nu trec prin filtrul glomerular); gama globulinele pot fi normale (sdr. nefrotic pur), scăzute (sdr. nefrotic impur) sau chiar crescute (patologii autoimune cu hipergamaglobulinemie); lipidele plasmatice, colesterolul crescute.

Modele proteice - Hepatita acuta - proteinele totale sunt normale; albuminele – normale spre limita inferioară, dar pot fi şi scăzute în funcţie de severitatea afectarii hepatice (au un turn-over de 21 zile, scăderea sintezei hepatice poate fi mascată de nivelul de albuminele existent în momentul declanşării bolii); alfa 1 şi alfa 2 globulinele – normale; beta globulinele – normale în fereastra imunologică, ulterior crescute prin IgM (pot migra şi în spectrul alfa 2 şi în beta, eventual asociate cu IgA în hepatitele alcoolice); gamma globuline normale în faza de debut şi crescute tardiv, când se face virajul imunologic;

Modele proteice - Hepatita cronica - proteine totale – normale; albumine – normale (HC incipiente) sau scăzute (HC decompensate parenchimatos); alfa 1 şi alfa 2 globulinele – normale; beta globuline – normale sau crescute în cazul unei hepatite cronice acutizate; gama globuline – crescute cu creştere moderată policlonală în cirozele de etiologie virală;

Modele proteice - Ciroza hepatica - proteine totale – scăzute; albumine – scăzute prin scăderea sintezei; alfa 1 şi alfa 2 – normale la limita inferioară sau scăzute; beta globuline – crescute; gama globuline – creştere moderată sau severă, de obicei policlonală – IgG, IgA, IgM; Ig crescute – catabolism scăzut și șuntarea pasajului hepatic;

AFP - alfa-1-fetoproteina serica Proteine anormale AFP - alfa-1-fetoproteina serica α globulina prezenta in sangele fetal sintetizata in ficat, tractul GI, sacul vitelin prezenţă fiziologică la făt şi în primul an după naştere, precum şi la gravide AFP in serul matern Dozarea trebuie combinata cu determinarea gonadotrofinei corionice si estriolului neconjugat cand varsta mamei >35 ani Scazuta in: trisomie 21, trisomie 18 coriocarcinom sarcina molara femeile cu DZ au valori cu 20-40% mai reduse decat femeile nediabetice Crescuta in: sarcina gemelara rasa (10-15%> la negri) defecte de tub neural – spina bifida deschisa, anencefalie, mielocel defecte de perete abdominal tetralogie Fallot sdr Turner cauze materne – neoplasme hepatice, ciroza hepatica

AFP - alfa-1-fetoproteina serica Proteine anormale AFP - alfa-1-fetoproteina serica La adult AFP: Marker tumoral pentru hepatom, tumori testiculare si ovariene (carcinom embrionar, teratom malign), neoplasme pancreatice, gastrice - în hepatite cronice, ciroze hepatice și convalescența după hepatita acută. Cresterile asociate cu conditii patologice nonmaligne sunt temporare, valorile scazand ulterior, in timp ce in afectiunile maligne cresterea valorii plasmatice continua Valoare > 50ng/ml este diagnostica pentru o tumora secretanta de AFP

Antigenul carcinoembrionar - ACE Proteine anormale Antigenul carcinoembrionar - ACE Intrauterin are rol în diferenţierea celulelor tubului digestiv; La adult – util in monitorizarea cc. colonic recurent sau metastatic dupa interventia chirurgicala, cc mamar, pulmonar, heptic, pancreatic ACE reflecta masa tumorala – nu e recomandat in screening datorita sensibilitatii si specificitatii scazute in stadiile incipiente ale afectiunilor maligne Alte afectiuni cu ACE crescut: Boli inflamatorii nonmaligne - colita ulcerativa, enterita, diverticulita, hepatita cronica, ciroza hepatica, insuficienta renala Valoare diagnostica – peste 2,5 ng/ml

Gonadotrofina corionică Proteine anormale Gonadotrofina corionică este secretată de sincitiotrofoblast, atinge valoarea maxima in S 8-11 si scade la minim in S 18, ramanand cst pana la sfarsitul sarcinii Utilizari: cel mai bun marker izolat pentru screeningul sdr Down diagnosticul precoce al sarcinii diagnosticul tumorilor germinative si cuantificarea eficientei terapiei acestora Rezultate fals pozitive la: - pacientii postorhiectomie – secundar scaderii testosteronului - fumatorii de marijuana

Proteine anormale CA 15-3, BR 27, BR 29 - detectarea recurentei cc mamar si monitorizarea raspunsului la tratament; modificarea semnificativa este de +/- 25% CA 19-9 – crescut in cc pancreatic (70-100%), pancreatita, cc gastric, hepato-biliar CA 27-29 – monitorizarea recurentei cc mamar CA 125 – creste in afectiuni benigne sau maligne care stimuleaza sinteza peritoneala – cc ovarian, endometrial, LMNH, cc pancreatic, hepatic, pulmonar, conditii de afecteaza endometrul (sarcina, menstruatie, endometrioza), inflamatii peritoneale, pleurale