ENZIMELE

OBIECTIVELE: Natura chimică şi rolul biologic al enzimelor. Dovezile naturii proteice a enzimelor. Diferenţa dintre acţiunea enzimelor şi catalizatorilor nebiologici. Structura enzimelor. Proenzimele (zimogenii). Noţiune despre centrul activ şi centrul alosteric al enzimelor. Izoenzimele şi rolul lor. Cofactorii enzimelor. Coenzimele şi ionii metalici. Funcţiile de coenzime a vitaminelor şi microelementelor. Natura chimică (structura) vitaminelor B1, B2, B6, PP şi rolul lor ca coenzime. Mecanismul de acţiune al enzimelor. Centrul activ al enzimelor şi rolul lui în formarea şi transformarea complecşilor intermediari dintre enzimă şi substrat. Rolul modificărilor conformaţionale reciproce ale moleculei enzimei şi substratului la favorizarea catalizei (reacţiei). Nomenclatura (denumirea) şi clasificarea enzimelor. Caracteristica generală a claselor şi subclaselor principale de enzime. Numărul de cod al enzimei.

ENZIMĂ – de la grec.“Eu ZYMOS”- în drojdie Enzime – catalizatori biologici de natură proteică, ce măresc viteza reacţiilor chimice E- acţionează strict într-o anumită consecutivitate şi cu o anumită specificitate

Natura chimică a E E- sunt proteine şi posedă toate proprietăţile fizico-chimice specifice acestor molecule (solubilitate, proprietăţi osmotice, sarcină electrică netă, denaturare termică) Dovezile experimentale: Sunt alcătuite din AA Prezintă macromolecule În apă formează sol. coloidale cu propriet. sale specifice Prezintă electroliţi amfoliţi Se supun denaturării Au fost sintetizate în condiţii de laborator din AA (ribonucleaza, lizozima)

Asemănările E cu catalizatorii neorganici catalizează numai reacţiile posibile din punct de vedere energetic nu modifică echilibrul reacţiilor reversibile nu modifică direcţia reacţiei nu se consumă în procesul reacţiilor.

Deosebirile E de catalizatorii neorganici Viteza catalizei enzimatice este cu mult mai mare decît a celei nebiologice (1 mg de Fe în componenţa catalazei poate înlocui o tonă de Fe metalic). Enzima posedă specificitate înaltă. Enzimele catalizează reacţiile chimice în condiţii blînde (presiunea obişnuită, temperatura 37C, pH aproape neutru). E catalizează reacţiile fără formarea produselor intermediare – randamentul este de 100% Activitatea E, de aici şi reacţiile enzimatice se reglează. Viteza reacţiilor este direct proporţională cu cantitatea enzimei.

Structura enzimelor Masa moleculară a E e de mii de ori mai mare decât masa moleculară a substratului (S) S - substanţa asupra căreia acţionează E E acţionează nu cu toată molecula dar cu un anumit sector – denumit centrul activ (CA) CA - locul care asigură interacţiunea E cu S şi transformarea ulterioară a acestuia.

Particularităţile CA Este o combinare unicală în spaţiu şi în timp a anumitor resturi de AA E o structură tridimensională (AA aflaţi în locuri diferite) Are formă de adâncitură sau cavitate, căptuşită cu AA hidrofobi, unde nu-i acces de apă (ex. când apa este un reagent al reacţiei) Ocupă o parte relativ mică din volumul E şi majoritatea resturilor de AA în molecula E nu contactează cu S S relativ slab se leagă cu E CA este alcătuit din 2 sectoare: Sectorul de contact (de legare) Sectorul catalitic

Centrul alosteric Unele E posedă şi un alt centru (sau alte centre) decît cel activ – centru alosteric (allo stereos –alt loc) C alos - are o poziţie spaţială pentru fixarea metabolitului reglator, numit efector sau modulator Modulatorii se fixează necovalent şi pot fi: activatori sau inhibitori E cu centrul alos – se numesc E alosterice sau reglatoare La fixarea modulatorului, E alos îşi modifică conformaţia. Modulatorii accelerează sau inhibă utilizarea S de enzima respectivă.

Reglarea alosterică E OH NH3 COO- -OOC NH3+ S Centru Activ Modulator Centru Alosteric OH NH3 -OOC COO- NH3+ S E Centru Activ Modulator

Enzime alosterice Moleculele enzimelor alosterice sunt mai mari, mai complexe şi sunt oligomere pare Au cinetica lor – viteza reacţiilor în dependenţă de c% S are formă sigmoidală, dar nu hiperbolică, cauzată de urmările interacţiunii între protomerii ce leagă S în mod cooperativ Sunt 2 tipuri de E alosterice Homotrope - modulatorul şi S constituie aceeaşi substanţă Acumularea S activează v reacţiei catalizate de această E (ex: alcoolul activează alcoolDH, E ce îl scindează) Heterotrope - modulatorul se deosebeşte după structură de S.

Cofactorii enzimelor Deosebim: E simple – alcătuite numai din AA E conjugate - sînt formate din: a. partea proteică - apoenzimă b. partea neproteică - cofactor. Cofactori – molecule (sau ioni) mici, mai stabili la acţiune decât apoenzimele Cofactorul strîns legat în structura E – grupare prostetică Cofactorul slab legat, uşor disociabil – coenzimă În calitate de cofactori apar frecvent cationii unor metale şi, foarte rar, unii anioni

Rolul Co stabilizează conformaţia activă a moleculei Prezintă veriga de legătură între S şi CA prin leg. coordinative Co pot îndeplini actul de cataliză Ex. – transportul electronilor

Clasificarea Co Co vitaminice Co nevitaminice Tiaminice Flavinice Nicotinamidice Piridoxinice Folice Cobamidice Biotinice lipoice Co nevitaminice (nucleotidice; metaloporfirinice,peptidice)

Coenzimele tiaminice Derivaţii vitaminei B1 TMP, TDP (TPP), TTP Rolul: Decarboxilarea oxidativă a piruvatului Decarboxilarea oxidativă a α cetoglutaratului Reacţii de transcetolare

Coenzimele flavinice Derivaţi ai vitaminei B2 FMN şi FAD Rolul: Participă în reacţiile de oxido-reducere: Dezaminarea AA (aminoacidoxidaza) Degradarea aldehidelor (aldehidDH) Degradarea purinelor (xantinoxidaza) Ciclul Krebs (succinatDH) Oxidarea AG DOP (dihidrolipoilDH)

Coenzimele nicotinamidice Sunt derivaţi ai vitaminei PP –niacina, niacinamida, B5 se include în structura a 2 Co- NAD şi NADP Rolul Participă în reacţiile de oxido-reducere (dehidrogenarea S –transferul unui hibrid ion (H+ şi 2 e). Alt proton rămâne în soluţie H+

Coenzimele nicotinamidice

Coenzimele piridoxinice Derivaţi a vitaminei B6 Co – piridoxalfosfat şi piridoxaminfosfat Rolul: Transaminarea AA Decarboxilarea AA Transsulfurarea

Ionii de metale –cofactori ai E E care în calitate de cofactori conţin metale – metaloenzime Metalele sunt fixate de apoenzimă prin legături electrostatice la care participă resturile de AA acizi (Asp, Glu) sau bazici (Arg, Lyz, His) Exemple: citocromii, catalaza (Fe) Citocromoxidaza (Cu) Amilaza salivară (Cl) alcoolDH (Zn)

Metalele ce intră în componenţa metaloenzimelor îndeplinesc următoarele funcţii: Stabilizează structura E Participă la legarea S Participă nemijlocit la cataliză Fixarea cofactorului la apoE (ex: Zn leagă NAD la alcoolDH)

Co pantotenice (B3)- HS-CoA biosinteza AG biosinteza Col sinteza corpilor cetonici Oxidarea AG Ciclul Krebs Sinteza aminolevulinatului DOP DO a alfa cetoglutaratului Transferul grupelor acil

Co biotinice – vitamina H Gluconeogeneză (I cale –piruvatdecarboxilaza) Sinteza AG (formarea lui malonil CoA) Transformarea propionil-CoA în succinil CoA (oxidarea AG cu număr impar) Intervine în catabolismul Leu

Co cobamidice – B12 -ciancobalamina Vitamină antipernicioasă pentru om şi factor de creştere pentru microorganisme În ficat sunt 3 compuşi cobalaminici: meti-; hidroxo- şi deoxiadenozil-cobalamină Rolul: Co pentru unele transmetilaze (homocisteină – metionină) Co pentru anumite mutaze (izomeraze)- metilmalonil Co A---- succinil CoA

Co folice sau pteridinice Bc-acidul folic Forma activă- acidul tetrahidrofolic Rol: transferul grupărilor cu un C: metil (CH3), metilen(-CH2), formil (COH), formimino (CH=NH)

Mecanismul de acţiune al enzimelor. Procesul catalizei enzimatice poate fi divizat convenţional în trei stadii: Difuzia S spre E şi legarea cu CA al E - formarea complexului ES. Prima etapă de scurtă durată depinde de concentraţia substratului şi de viteza lui de difuzie spre centrul activ al enzimei.

Mecanismul de acţiune al E 2. Transformarea complexului primar ES în unul sau cîteva complexe activate, indicate în ecuaţie prin ES* şi ES**. Această etapă este cea mai lentă şi depinde de energia de activare a reacţiei chimice respective. La această etapă are loc dereglarea legăturilor S, ruperea lor sau formarea noilor legături în urma interacţiunii grupelor catalitice ale enzimei. 3. Despărţirea produselor reacţiei de CA al E şi difuzia lor în mediul ambiant (complexul EP disociază în E şi P).

Ipoteza “lacăt-cheie” (Fischer) şi “coincidenţa forţată” (Kochland) Modelul clasic (Emil Fischer) consideră că potrivirea substratului cu centrul activ al enzimei este analog cu potrivirea “lacăt-cheie”. Acest model presupune o rigiditate a structurii enzimei în zona centrului activ. modelul Kochland, numit “centrul activ indus”, presupune o flexibilitate a CA. În enzima liberă CA este “preformat” într-o configuraţie spaţială uşor diferită de cea necesară fixării S. S induce o modificare conformaţională a CA, care favorizează fixarea lui

Conceptul clasic "lacăt- cheie elaborat în 1890 de către Emil Fişer consideră că potrivirea substratului cu centrul activ al enzimei este analog cu potrivirea “lacăt-cheie”. Acest model presupune o rigiditate a CA. la prima etapă a formării acestui complex în rezultat se modifă structura S căpătînd starea de tranziţie după care se transformă în P E+S-- ES- E+P E S P2 P1

Conceptul coencidenţei inductive “coincidenţa forţată” (Kochland) S P2 P1

Mecanismul de acţiune al E La nivel molecular acţiunea E poate fi lămurită prin următoarele efecte: Efectul de orientare a substratelor (CA al E fixează S şi le orientează într-un mod convenabil pentru acţiunea gr. catalitice) Efectul de deformare a S (după unirea în CA molecula S se întinde, se deformează –favorizând scindarea ei) Cataliza acido-bazică (în procesul fixării S în CA asupra lui acţionează grupele electrofile ale sectorului catalitic, are loc redistribuirea densităţii electronice în S şi ruperea legăturilor din S Cataliza covalentă – formarea legăturilor covalente între CA şi S, complexul ES e foarte instabil, uşor disociază eliberând P reacţiei

Mecanismul de acţiune al E Pentru decurgerea unei reacţii este necesar ca molecula de S şi E să contacteze între ele, pentru aceasta e necesar de conştientizarea unei noţiuni ca: Energia de activare – este energia necesară tuturor moleculelor unui mol de substanţă, care la o anumită t pot să atingă starea de tranziţie corespunzătoare apixului barierii energetice (KJ/mol; kcal/mol) E - micşorează energia de activare ale reacţiilor chimice. Cu cît mai mult scade energie de activare, cu atît mai eficient acţionează catalizatorul, şi cu atît mai mult se accelerează reacţia.

Enzymes Lower a Reaction’s Activation Energy

Clasificarea actuală a enzimelor. Toate enzimele se împart în şase clase, clasele în subclase, subclasele în subsubclase, iar aici E îşi are numărul său de ordin. Clasele, subclasele, sub-subclasele şi enzimele individuale se notează prin cifre despărţite de puncte. Ex: LDH - 1.1.1.27 Clasa reprezintă tipul de reacţie, catalizat de enzime Subclasa – precizează acţiunea E, deoarece indică natura grupării chimice a S, atacat de E Subsubclasa – precizează natura legăturii S atacat sau natura acceptorului care participă la reacţii Denumirea E – denumirea S +tipul reacţiei catalizate +aza

Clasificarea actuală a enzimelor Oxidoreductaze, catalizează reacţiii de oxido-reducere; Transferaze, catalizează transferuri grupelor funcţionale de la un S la altul (metil, amino, acil,); Hidrolaze catalizează scindări de legături covalente cu adiţionarea apei ; Liaze, catalizează ruperea leg. C-C, C-S şi C-N; fără adiţionarea apei, adiţia la legături duble şi reacţiile inverse. Izomeraze, catalizează toate tipurile de transformări în cadrul uneia şi aceleaşi moleculă ; Ligaze (sintetaze), catalizează formarea de legături între carbon şi O, S, N, cuplate cu hidroliza legăturilor macroergice (utilizarea ATP).

Clasificarea enzimelor. - catalizează reacţiii de oxido-reducere; catalizează transferuri grupelor funcţionale de la un S la altul (metil, amino, acil,); catalizează scindări de legături covalente cu adiţionarea apei ; catalizează ruperea leg. C-C, C-S şi C-N; fără adiţionarea apei, adiţia la legături duble şi reacţiile inverse. catalizează toate tipurile de transformări în cadrul uneia şi aceleaşi moleculă ; - catalizează formarea de legături între carbon şi O, S, N, cuplate cu hidroliza legăturilor macroergice (utilizarea ATP).

Izoenzimele forme moleculare multiple ale E (la aceeaşi specie, în acelaşi ţesut, în aceeaşi celulă), ce catalizează aceeaşi reacţie chimică, dar se deosebesc prin structură, proprietăţi fizice, chimice şi cinetice Diferite forme de izoenzime se pot găsi fie împreună; fie în ţesuturi diferite (fosfotaza acidă în prostată şi hematii); sau chiar în diferite părţi ale aceleiaşi celule (MDH mitocondrială şi citoplasmatică) Sunt E cu structură cuaternară, alcătuite din cel puţin 2 protomeri diferiţi Ex. LDH (lactat – piruvat) Prezintă un tetramer, alcătuit din 2 tipuri de subunităţi (H – inimă; M- muşchi) în diferite raporturi; codificate de gene diferite. HHHH – inimă; HHHM;HHMM; HMMM; MMMM – muşchi Izoenzimele diferă între ele prin: V max de cataliză, prin sensibilitatea faţă de modulatorii alosterici, prin sarcina electrică (ce permite separarea lor prin electroforeză); pH-optim de acţiune; termolabilitate, au afinitate diferită faţă de S.

Rolul: Rol însemnat în controlul metabolic ( faciliteaza adaptarea metabolismului in diferite ţesuturi.) Ex: in miocard predomina HHHH aceasta izoenzima este inhibata de către piruvat deaceea orientează oxidarea piruvatului pe cale aeroba. Pe cind fracţia M4 este activată de catre piruvat şi orientează transformarea piruvatului pe cale anaerobă spre lactat. Variaţia diferitor forme de izoenzime are o semnificaţie diagnostică deosebită în unele stări patologice. Exemple de izoenzime: creatinkinaza (2 tipuri de monomeri: M-Muscle şi B –brain MDH Aldolaza Fosfataza alcalină Fosfataza acidă

Proprietăţile generale ale enzimelor

Obiectivele: 2. Activarea şi inhibarea enzimelor: 1. Proprietăţile generale ale E (termolabilitatea, specificitatea), acţiunea pH-ului asupra activităţii enzimatice. 2. Activarea şi inhibarea enzimelor: a) mecanismele de activare (proteoliza parţială, activarea alosterică, autostructurarea cuaternară, fosforilarea şi defosforilarea, reactivarea). b) mecanismele de inhibiţie (specifică şi nespecifică, reversibilă şi ireversibilă, alosterică şi competitivă). 3. Organizarea enzimelor în celulă (ansamblurile enzimatice, compartimentalizarea). Reglarea activităţii enzimatice în celulă — importanţa principiului de retroinhibitie. 4. Deosebirea privind componenţa enzimatică a organelor şi ţesuturilor. Enzimele organospecifice. Modificarea activităţii enzimatice în diferite afecţiuni (enzimodiagnosticul). 5. Metodele de obţinere şi purificare ale enzimelor. Cromatografia de afinitate. 6. Utilizarea enzimelor în practica medicală. Întrebuinţarea enzimelor imobilizate în medicină. 7. Unităţile de activitate ale enzimelor. 8. Metodele de determinare a activităţii enzimelor.

Factorii care influienţiază activitatea E Temperatura PH Concentraţia S Concentraţia E electroliţii

Termolabilitatea (t°) E – sunt termolabile t optimă a majorităţii E se află în limitele 20 ° - 40° C odată cu creşterea t cu 10°C (dacă luăm punctul de plecare 0° ) - V reacţiei enzimatice sporeşte de 1,5 ori, atingând max la t 40°C. Majorarea de mai departe duce la micşorarea activităţii enzimatice ceea ce mărturiseşte despre denaturarea proteinei. La 100°C toate E organismului sunt inactive. Unele E a microorganismelor termofile sunt active la t de 80°C La t joase E se inactivează (excepţii: catalaza: activitate max la t=0 °C)

Termolabilitatea (t°) Creşterea vitezei reacţiei odată cu creşterea t° este înterpretată prin prisma "energiei de activare". Pentru fiecare E se poate stabili o t° optimă la care V atinge valoarea max, mai departe V scade din cauza denaturării.

Acţiunea pH asupra activităţii enzimatice Fiecare E are un pH optim propriu la care îşi manifestă activitatea maximală. Majoritatea E celulare au pH-ul optim- 7,4 (excepţii: hidrolazele acide lizozomale pH= 5; MAO din membrana mitocondrială externa pH= 10). La E digestive pH-lui optim este cel al sediului lor de acţiune: Pepsina – pH 1,5 – 2, Amilaza pancreatică - pH 6,4-7,2, Tripsina - pH 7,8-8,0 Arginaza- pH 9,5-10 etc.

Dependenţa activităţii E de variaţia pH-ului este deseori descrisă de o curbă în forma de clopot. In CA al E se află grupări ionizabile, acide sau bazice. Acestea interacţionează direct cu ionii H+ si OH-, rezultatul fiind creşterea sau scăderea gradului lor de disociere Deci mărind sau micşorînd pH-ul mediului, se poate regla activitatea catalitică a E. pH optim e dependent de: gradul de ionizare a grupelor funcţionale, afinităţii E faţă de S, stabilităţii E.

[E] în condiţii standard 2 mol de E într-o anumită perioadă de timp vor transforma de 2 ori mai multe molecule de S decît 1 mol de E (relaţie direct proporţională).

[S] Grafic se reprezintă sub formă de o curbă de tip hiperbolic. în perioada iniţială a reacţiei V creşte pe măsură ce creşte [S]. La un moment dat cînd CA al E se ocupă de S – V nu mai creşte. Ea rămîne constantă şi corespunde V max a reacţiei. În cazul E alosterice – curba reprezintă un aspect sigmoid

[S] unde: V-Vreacţiei la un moment dat Analiza curbei hiperbolice arată că ea reprezintă 3 zone: a. V de reacţie creşte proporţional cu c% S b. Creşterea este mai încetă c. V de reacţie nu mai creşte Această curbă este numită curba lui Michaelis-Menten şi se exprimă prin ecuaţia: [S] unde: V-Vreacţiei la un moment dat V=Vmax x _________ Vmax- viteza max Km +[S] Km-constanta lui Michaelis Menten [S] –C% molară a S Km- este acea concentraţie de S pentru care v de reacţie este jumătate din Vmax. Km reflectă afinitatea E pentru S şi anume cu cât Km este mai mică cu atît afinitatea este mai mare şi invers.

Specificitatea este capacitatea unei E de a selecta dintr-un număr de compuşi S particular. este o proprietate a E, care instituie eficienţă şi ordine în metabolism, prevenind desfăşurarea lui haotică. este condiţionata de complimentaritatea conformaţională şi electrostatică între CA al E şi S.

Specificitatea este capacitatea unei enzime de a selecta dintr-un număr mare de S unul particular, este condiţionată de complimentaritatea conformaţională şi electrostatică între CA al E şi S. E S1 S4 S2

Deci fiecare E catalizează un anumit tip de reactii sau transformarea unui anumit S.

Specificitate de substrat: stereochimică, absolută şi relativă : Specificitatea: Specificitatea de reacţie: E-catalizează un anumit tip de reacţie ce stă la baza clasificării enzimelor: o hidroliza, o reacţie redox, formarea unei legături, etc. Specificitate de substrat: stereochimică, absolută şi relativă : Specificitate stereochimică - E catalizează transformarea numai a unuia din stereoizomerii posibili. Ex: Amilaza scindează legăturile α 1-4 glucozidice din amidon sau glicogen şi nu influentează asupra legăturilor β din celuloza.

specificitate de S relativă – specificitate de S absolută - E catalizează transformarea doar a unui S (anhidraza carbonica, ureaza). specificitate de S relativă – E acţionează nu asupra unor grupe din mol S ci asupra anumitor legături a anumitei grupe de S (proteazele: chimotripsina - legatura peptidica, formata de COOH a Phe, Tyr, Trp; tripsina - de COOH a Lyz si Arg). E catalizează transformarea grupei de substanţe asemănătoare (alcoolDH) E catalizează transformarea substanţelor care aparţin diferitor grupe de compuşi organici (cit. P450)

Mecanismele de activare a E Sunt : 1. nespecifice: temperatura , iradierea 2. specifice Se activează la: majorarea concentraţiei S cînd este insuficient majorarea cantităţii E introducerea coenzimelor cînd sunt insuficiente Introducerea ionilor metalelor Fe, Cu Se cunosc următoarele tipuri de reglare a activităţii enzimatice: proteoliza limitata Reglare covalentă – fosforilare/ defosforilare Autostructurarea cuaternară Alosterică Reactivare

Proteoliză limitată Unele enzime (proteine) se sintetizează în forma neactivă de precursor – proenzime (zimogeni) Exemplu: 1) enzimele digestiei: pepsinogenul, himotripsinogenul, tripsinogenul, proelastaza, procarboxipeptidaza - scindeaza proteinele in stomac şi duoden. 2) coagularea singelui e determinată de cascada de reacţii cu activitate proteolitică; 3) hormonii proteici (insulina); 4) proteinele fibrilare (colagenul). Mecanismele de activare a proenzimelor este proteoliza limitata. Proteoliza limitata - este scindarea (înlăturarea) unui sector al catenei în rezultat enzima se restructurează şi se formează CA. H+ Pepsinogen ------→pepsină -42AA

Importanla biologică a prezenţei formelor neactive . 1. Protejază de proteoliză proteinele celulelor producătoare de E. 2. Este o forma de rezervă a E, care rapid pot fi activate şi interven în reacţie.

Reglarea covalentă (fosforilare-defosforilare) Activitatea unor E se modifică prin fosforilare. Reacţiile de fosforilare sunt catalizate de kinaze specifice. E-OH + ATP --------→ E-O-P +ADP Defosforilarea are loc sub acţiunea fosfotazei specifice E-OP +H2O-------→ E-OH +H3PO4 unele enzime sînt active în forma fosforilată, iar altele în forma defosforilată. Ex.: glicogen fosforilaza – activă în forma fosforilată; glicogen sintaza – este activă în forma defosforilată

Autostructurarea cuaternară Este caracteristică E ce posedă structură cuaternară Fiecare protomer în parte nu posedă activitate enzimatică La asamblarea lor – se modifică conformaţia fiecărui protomer şi corespunzător se modifică şi conformaţia CA, devenind astfel favorabil pentru fixarea şi transformarea S

Reglarea alosterică Modulator pozitiv E Allos M S CA CA

Inhibiţia activităţii enzimelor Deosebim: inhibiţie nespecifică (T, pH, agenţii denaturării ) inhibiţie specifică Inhibiţia poate fi reversibilă şi ireversibilă. La inhibiiţia ireversibilă inhibitorul covalent se fixează de enzimă sau se leagă atît de puternic încît disociaţia are loc foarte incet. Exemple: cianurile se fixează cu Fe 3+ din citocromoxidază ---se întrerupe LR; ionii metalelor grele (mercur, plumb) inhibă gruparea SH a multor E La o inhibiiţie reversibilă - inhibitori se fixeaza slab, necovalent de E Inhibiţie competitivă Inhibiţie necompetitivă Inhibiţie prin exces de S Inhibiţie alosterică

Inhibiţie competitivă Inhibitorul se aseamănă după structură cu S şi se fixează în CA al E, împedicând fixarea şi transformarea S. Nu e posibilă fixarea simultană a S şi a I. E va fixa pe acel competitor care se afla intr-o concentraţie mai mare. inhibiţia enzimei (SDH)cu malonat. SDH oxideaza succinatul in fumarat) Malonatul inhiba aceasta E datorita asemanarii cu S. H I -OOC-CH S SDH E FAD I -OOC-CH Particularitatea principală a acestui tip de inhibiţie este că poate fi înlăturată cu adăugarea în exes a S(succinat). SDH E FADH2 P -OOC < CH2 I SDH E FAD

Inhibiţia competitivă I se aseamănă după structură cu S. Apare o competiţie dintre I şi S pentru CA. Nu e posibil simultan fixarea S şi a I. E va fixa pe acel competitor care se află intr-o concentraţie mai mare. E+I ---- EI Inhibiţia competitivă diminuează v catalizei, micşorînd cota moleculelor de E fixatoare a S. Exemplu: inhibiţia SDH cu malonat (SDH -oxideaza succinatul in fumarat). Malonatul inhibă aceasta E datorită asemănării cu S.

Inhibiţia necompetitivă inhibitorul nu se aseamănă ca structura cu S I şi S se leagă simultan cu E dar locusurile sint diferite E+S+I--------- →ESI Acest tip de inhibiţie nu se înlătură prin exces de substrat. Activitatea I constă în micşorarea numărului turnover al E, dar nu şi numărul de molecule de S. Cei mai de vaza inhibitori de acest tip în celulele vii sint produsele intermediare ale metabolismului, care reversibil se fixeaza cu locusuri specifice pe suprafata unor enzime reglatoare şi modifică activitatea lor. I poate fi înlăturat de substanţe care îl leagă – numite reactivatori

Inhibiţie necompetitivă I şi S se leagă simultan cu E în locusuri diferite COO- NH3+ S E Mărirea concentraţiei de S nu micşoreaza inhibiţia. Centru Activ Inhibotor Cei mai de vază inhibitori de acest tip în celulele vii sint produsele intermediare ale metabolismului, care reversibil se fixează la unele E reglatoare şi modifică activitatea lor.

Inhibiţia noncompetetivă – I se leagă la complexul ES, inhibă activitatea E E+S----ES +I-----ESI inhibiţia prin modificarea covalentă a moleculei enzimei - prin fosforilare pe baza ATP-ului. Unele enzime fosforilate pierd activitatea de exemplu enzima glicogensintetaza Inhibiţia prin exces de S – în CA se fixează simultan surplus de S – ce nu poate fi transformat. Este o inhibiţie reversibilă – înlăturarea S. Retroinhibiţie -

Inhibiţie prin exes de S COO- NH3+ S E Centru Activ S

- Inhibiţie alosterică Centru Alosteric OH NH3 -OOC COO- NH3+ S E Centru Activ Modulator

Reglarea alosterică Modulator negativ Inhibiţie alosterică - inhibitorul (efectorul) se leagă în centrul alosteric al enzimei, modificând conformaţia moleculei (structura terţiară) ce are ca consecinţă deformarea centrului activ. E Allos M S CA CA

Retroinhibiţie B C A D P E E E E 2 3 4 1

Sistemele polienzimatice Tipurile de organizare a sistemelor polienzimatice Fiecare celulă a organismului conţine setul său specific de E. Unele se găsesc în toate celulele, altele sunt prezente doar în anumite celule sau anumite compartimente celulare. Funcţia fiecărei E, nu este izolată, ci strins legată de funcţia altor enzime. Astiel din E aparte se formeaza sisteme polienzimatice sau conveiere. Funcţia sistemelor polienzimatice depinde de particularităţile de organizare a lor in celule. Se cunosc urmatoarele tipuri de organizare a sistemelor polienzimatice: - funcţională, - structural-funcţională - mixtă.

Organizarea funcţională enzimele sunt asociate în sistemul polienzimatic cu ajutorul metaboliţilor, care difuzează de la o enzimă la alta. produsul reacţiei primei enzime serveşte drept substrat pentru enzima următoare etc. Ex.: glicoliza. Toate enzimele participante la glicoliza sunt în stare solubilă, legătura se face doar prin intermediarii metabolici. E1 E2 E3 E4 A----------------→ B-------------→ C---------- →D----------→ P

Organizarea structural-funcţională E sunt fixate prin legături slabe, într-o ordine corespunzătoare întrării lor în acţiune, pe o proteină “centrală”, care poate fi chiar una din enzime. Proteina centrală dispune de un “braţ” care fixează S şi îl duce la E1, care îl transformă în P1; P1devine în acest caz S2 , braţul îl preia şi îl duce la E2, care îl transformă în P2. La nivelul fiecărei E braţul îndeplineşte rol similar asigurînd formarea produsului unic al tuturor enzimelor complexului. Avantajul este că braţul duce de fiecare dată S la E corespunzătoare, potrivindu-l cu mare exactitate pe CA, ceea ce asigură în ansamblu o viteză mai mare decît cea corespunzătoare acţiunii enzimelor neasociate. Ex.- complexul polienzimatic piruvatdehidrogenazic, constituit din 3 E şi 5 Co sau sintetaza acizilor graşi constituită din şapte enzime legate structural, care în ansamblu îndeplinesc funcţia de sinteza a acizilor grasi. Afară de complexele multienzimatice e posibila şi o altă varianta de organizare structural-funcţională. Astfel E se pot aranja în lanţ, fixîndu-se de membrana biologică. Ex.enzimele lanţului respirator mitocondrial, care participă la transferul de electroni şi protoni şi la generarea de energie.

Tipul mixt de organizare reprezintă o îmbinare a ambelor tipuri de organizare, adică o parte din sistemul polienzimatic are organizare structurala, iar cealalta parte - organizare funcţională. Ex.- ciclul Krebs, unde o parte din enzime sunt asociate în complex structural (complexul 2-oxoglutaratdehidrogenazic), îar altă parte se leagă funcţional prin metaboliţii de legătură.

Unităţile de activitate ale enzimelor Unitatea Internaţională (U.I.) – cantitatea de E care catalizează transformarea 1μmol de S într-un minut în condiţii standard Katal (kat) – cantitatea de E care asigură transformarea unui mol de S într-o secundă în condiţii standard (1U.I.=16,67 nkat)

Enzimele indicatorii – sunt localizate intracelular: Deosebirea privind componenţa enzimatică a organelor şi ţesuturilor. Enzimele organospecifice. Modificarea activităţii enzimatice în diferite afecţiuni (enzimodiagnosticul). Enzimele indicatorii – sunt localizate intracelular: în citoplasmă (lactatdehidrogenaza, aldolaza), în mitocondrii glutamatdehidrogenaza), în lizosomi (-glucoronidaza, fosfataza alcalină). Acestea enzime în normă în plasmă se găsesc în concentraţii foarte mici. La afecţiunile celulare activitatea acestor enzime în plasmă este brusc mărită.

Terapia cu enzime Enzimele sunt agenţi terapeutici unici ce produc efecte importante şi specifice. Motivele care au limitat folosirea largă a enzimelor ca medicaţie e natura protC:IC6:legată de natura proteică: - distribuţie redusă în organism dependenţa de dimensiuni, sarcina şi de fenomenele de glicozilare (prin glicozilare proteinele sunt recunoscute de receptori şi fixate în anumite locuri - posibilitate mică de dirijare extrahepatică, ficatul avînd tendinţă de a căptăta şi reţine proteinele străine; - inactivarea lor sub acţiunea proteazelor digestive în cazul administrarii orale, iar proteazele tisulare le scurteaza de asemeni actiunea; - potentialul lor antigenic, anticorpii formati pot genera reacţii de hipersensibilizare adesea grave şi pot inactiva enzima.

Tehnici propuse pentru optimizarea proprietăţilor terapeutice ale enzimelor. - prin N-acilare a fost crescută semiviata asparaginazei, folosită în leucemie - S-au incercat de asemeni metode de obţinere a enzimelor imobilizate. De ex. prin reticularea enzimei, ce conduce la agregate insolubile, prin adsorbţie pe polimeri sintetici ori prin ataşare covalentă, sau prin incorporare într-un gel in cursul polimerizarii. Aceste preparate caştiga rezistenţa la enzimele proteolitice şi sunt mai putin imunoactive dar pot fi alterate proprietaisile farmacocinetice. Asemenea avantaje au dovedit conjugatii cu polietilenglicol (PEG) ai arginazei, ai glutaminasparaginazei sau ribonucleaza supusa reticularii, enzime cu efect antitumoral. Un succes în terapia defectelor genetice a fost imobilizarea enzimelor din ciclul ureogenetic pe un suport de fibrina. S-au propus noi forme farmaceutice prin incapsularea enzimelor in lipozomi - microsfere cu membrana bistratificata lipido proteica, in hematii umane, in fantome eritrocitare sau in alti transportori celulari. Noile forme obţinute prezintă un potenţial de ţîntire tisulară. De ex. in cazul unor boli genetice cauzate de deficitul unor enzime lizozomale se impune o terape de substitutie, enzima trebuind tintita direct in lizozomi.

Tipurile de organizare a sistemelor polienzimatice: Organizarea funcţională - enzimele sunt asociate în sisteme polienzimatice, care îndeplinesc o anumită funcţie. Produsul reacţiei prirmei enzime a lanţului serveşte drept substrat pentru enzima următoare etc. Ex.de organizare funcţională - enzimele glicolizei, unde toate E participante se găsesc în stare solubilă; Fiecare reacţie este catalizată de enzime aparte. Drept verigă de legătura aici servesc metaboliţii. Organizarea structural-funcţională consta în faptul ca enzimele formează sisteme structurale cu o anumită funcţie. Ex.- complexul polienzimatic piruvatdehidrogenazic, constituit din cîteva enzime, care participă la oxidarea acidului piruvic, sau sintetaza acizilor graşi constituită din şapte enzime legate structural, care în ansamblu îndeplinesc funcţia de sinteza a acizilor grasi. Afară de complexele multienzimatice e posibila şi o altă varianta de organizare structural-funcţională. Astfel enzimele se pot aranja în lanţ, fixindu-se de membrana biologică. Ex.enzimele lanţului respirator mitocondrial, care participă la transferul de electroni şi protoni şi la generarea de energie. Tipul mixt de organizare a sistemelor polienzimatice reprezintă o îmbinare a ambelor tipuri de organizare, adică o parte din sistemul polienzimatic are organizare structurala, iar cealaltă parte - organizare funcţională. Ex.- ciclul Krebs, unde o parte din enzime sunt asociate în complex structural (complexul 2-oxoglutaratdehidrogenazic), îar altă parte se leagă funcţional prin metaboliţii de legătură.

Deosebirea privind componenţa enzimatică a organelor şi ţesuturilor Deosebirea privind componenţa enzimatică a organelor şi ţesuturilor. Enzimele organospecifice. Modificarea activităţii enzimatice în diferite afecţiuni (enzimodiagnosticul). Enzimele indicatorii – sunt localizate intracelular: în citoplasmă (lactatdehidrogenaza, aldolaza), în mitocondrii glutamatdehidrogenaza), în lizosomi (-glucoronidaza, fosfataza alcalină). Acestea enzime în normă în plasmă se găsesc în concentraţii foarte mici. La afecţiunile celulare activitatea acestor enzime în plasmă este brusc mărită.

Unităţile de activitate ale enzimelor. Unitatea Internaţională (U.I.) – cantitatea de E care catalizează transformarea 1μmol de S într-un minut în condiţii standard Katal (kat) – cantitatea de E care asigură transformarea unui mol de S într-o secundă în condiţii standard (1U.I.=16,67 nkat)

Terapia cu enzime Enzimele sunt agenţi terapeutici unici ce produc efecte importante şi specifice. Motivele care au limitat folosirea largă a enzimelor ca medicaţie sunt legate de natura proteică: - distribuţie redusă în organism dependenţa de dimensiuni, sarcina şi de fenomenele de glicozilare (prin glicozilare proteinele sunt recunoscute de receptori şi fixate în anumite locuri - posibilitate mică de dirijare extrahepatică, ficatul avînd tendinţă de a căptăta şi reţine proteinele străine; - inactivarea lor sub acţiunea proteazelor digestive în cazul administrarii orale, iar proteazele tisulare le scurteaza de asemeni actiunea; - potentialul lor antigenic, anticorpii formati pot genera reacţii de hipersensibilizare adesea grave şi pot inactiva enzima.

Tehnici propuse pentru optimizarea proprietăţilor terapeutice ale enzimelor. - prin N-acilare a fost crescută semiviata asparaginazei, folosită în leucemie - S-au incercat de asemeni metode de obţinere a enzimelor imobilizate. De ex. prin reticularea enzimei, ce conduce la agregate insolubile, prin adsorbţie pe polimeri sintetici ori prin ataşare covalentă, sau prin incorporare într-un gel in cursul polimerizarii. Aceste preparate caştiga rezistenţa la enzimele proteolitice şi sunt mai putin imunoactive dar pot fi alterate proprietaisile farmacocinetice. Asemenea avantaje au dovedit conjugatii cu polietilenglicol (PEG) ai arginazei, ai glutaminasparaginazei sau ribonucleaza supusa reticularii, enzime cu efect antitumoral. Un succes în terapia defectelor genetice a fost imobilizarea enzimelor din ciclul ureogenetic pe un suport de fibrina. S-au propus noi forme farmaceutice prin incapsularea enzimelor in lipozomi - microsfere cu membrana bistratificata lipido proteica, in hematii umane, in fantome eritrocitare sau in alti transportori celulari. Noile forme obţinute prezintă un potenţial de ţîntire tisulară. De ex. in cazul unor boli genetice cauzate de deficitul unor enzime lizozomale se impune o terape de substitutie, enzima trebuind tintita direct in lizozomi.

Vă mulţumim pentru atenţie

Metodele de determinare a activităţii enzimelor.

Metodele de determinare a activităţii enzimelor.