Proteini

Molekuli sa hiralnim centrom su optički aktivne supstance - rotiraju ravan polarizovane svetlosti (sve AK sem glicina).

Aminokiseline su amfoterna jedinjenja U vodenim rastvorima predominantno u jonizovanoj cviterjonskoj formi, zato ih odlikuje mala rastvorljivost u organskim rastvaračima (hloroform, etar...).

pH vrednost na kojoj se aminokiseline nalaze u dipolarnoj formi sa neto naelektrisanjem jednakim nuli se naziva izoelektrična tačka pI

Formiranje peptidne veze

Proteini su polimeri ak Oko peptidne veze nema rotiranja

Strukturni nivoi organizacije

Vežba 1. Taloženje proteina solima metala FeCl3 i CuSO4 se dodaju rastvoru proteina (belance), ove soli u vodi disosuju na pozitivan jon metala (katjon). Reakcija se odvija u baznom rastvoru proteina, pri čemu su oni dominantno negativno naelektrisani zbog negativno naelektrisanih karboksilnih grupa. Katjoni metala se vezuju za ove negativne grupe, u jednom trenutku počinje agregacija proteina u rastvoru i oni počinju da se talože. Ako nastavimo dodavanje soli dolazi do adsorpcije pozitivnih jona, protein postaje naelektrisan i rastvorljiv. Pažljivo dodavanje rastvora soli je neophodno, prestati sa dodavanjem rastvora čim primetite zamućenje!!!!

Vežba 2. Taloženje proteina alkaloidnim reagensima Zasniva se na adsorpciji kompleksnih negativno naelektrisanih anjona nastalih disocijacijom alkaloidnih soli. Reakcija je efikasna samo u kiseloj sredini kada su bočne grupe proteina pozitivno naelektrisane. Beli talog se dobija u slučaju taloženja sulfosalicilnom kiselinom. Žuti talog se dobija pri taloženju rastvorom limunske i pikrinske kiseline (Esbach-ov reagens).

Vežba 3. Taloženje proteina alkoholom Vežba 4. Koagulacija zagrevanjem

Vežba 5. Ksantoproteinska reakcija Zasniva se na nitrovanju fenolnog prstena aromatičnih aminokiselina pomoću HNO3 Nastaje beli talog, koji posle zagrevanja požuti. Dodavanjem NaOH rastvor postaje alkalan i formirana nitro jedinjenja jonizuju dajući jarko žutu ili narandžastu boju usled jonizacije fenolne grupe. *Obavezno koristiti propipetu pri radu sa koncentrovanim kiselinama i bazama !!!!!

Vežba 6. Test sa merkuri-nitratom Zasniva se na taloženju proteina živom koja reaguje sa tirozinom. Jedinjenje koje nastaje u reakciji proteina sa živom postaje crveno posle tretiranja sa NaNO3

Vežba 7. Aldehidna reakcija za triptofan Zasniva se na kondenzaciji triptofana sa aldehidima u prisustvu koncentrovane sumporne kiseline i tragova oksidacione supstance dajući produkt purpurne (ljubičaste boje)

Vežba 8. Cisteinska reakcija U reakciji nastaje mrki talog kao posledica formiranja olovo sulfida PbS po dodatku NaOH i Pb (CH3COO)2

Vežba 9. Biuretska reakcija Karakteristična je za jedinjenja sa peptidnim vezama, ne daju je slobodne aminokiseline. Daju je jedinjenja sa najmanje dve peptidne veze. Kada se proteini tretiraju razblaženim rastvorom bakar sulfata u alkalnoj sredini formira se ružičasta boja.

Vežba 10. Molish-ova reakcija Dokazna reakcija za glikoproteine, ili prisustva ugljenih hidrata u u uzorku proteina.

Vežba 11. Kvantitativno određivanje proteina Spektrofotometrijska metoda Kolorimetrijske metode: Bradford-ova metoda Lowry-eva metoda

Spektrofotometrijska metoda Lambert-Beer-ov zakon

Lorijeva (Lowry) metoda

Lorijeva metoda se zasniva na merenju apsorbancije koja potiče od dva obojena kompleksa – biuretskog i redukovanog fosfomolibdenskog-fosfovolframovog kompleksa. Pri prelasku u redukovano stanje menjaju žutu boju u plavu. Intenzitet razvijene plave boje u reakciji se očitava na 750nm i proporcionalna je koncentraciji proteina.

Standardna kriva za određivanje koncentracije proteina

Određivanje nepoznate koncentracije proteina pomoću standardne krive Prvi korak je konstrukcija standardne krive korišćenjem Microsoft Office Excel programa na sledeći način: U kolonu A unesite koncentracije standardnih rastvora koje ste koristili 0, 100, 200,300 U kolonu B unesite odgovarajuće vrednosti apsorbancije. U B1 unosite vrednost 0, a potom počevši od B2 vrednosti koje ste izmerili. * Vrednosti 0 u koloni A i B niste izmerili, one se unose da bi stendardna kriva prolazila kroz koordinatni početak.

Određivanje nepoznate koncentracije proteina pomoću standardne krive Potom označite rezultate, izaberite opciju INSERT, zatim SCATTER i prvu opciju iz ovog padajućeg menija. Kada to uradite dobićete grafik .

Izaberite opciju CHART LAYOUT i LAYOUT 9 koji daje jednačinu prave.

Obrišite legende na grafiku sa desne strane i imenujete grafik sa: Standardna kriva za određivanje koncentracije proteina, i ose X : Koncentracija proteina (μg/ml), a Y osu sa: Apsorbancija na 750nm (ovo se radi klikom na CHART TITLE i AXIS TITLE)

Dobijeni grafik odštampajte i zalepite u praktikum na strani predviđenoj za overu. Na grafiku postoji jednačina prave oblika y=ax+b, da bi odredili nepoznatu koncentraciju proteina, u jednačinu morate uvrstiti za y vrednost apsorbancije koju ste izmerili u uzorku nepoznate koncentracije (?) Dakle vrednost koju dobijete za x je nepoznata koncentracija proteina. Račun prikazati ispod grafika koji ste zalepili u praktikumu na strani za overu.