Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD 23 Νοεμβρίου 2017 Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας – Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Εργαστήριο Βιοχημειας ΙΙ Βασικές έννοιες Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD 23 Νοεμβρίου 2017

Εργαστηριακός εξοπλισμός Σκεύη Ηλεκτρικές Συσκευές

Σκεύη Γυάλινα Πορσελάνινα Πλαστικά Μεταλλικά

Γυάλινα σκεύη Ποτήρια ζέσεως, (χωρητικότητας 50-2000 ml) Σφαιρικές φιάλες με εσμυρισμένο πώμα Ογκομετρικοί κύλινδροι (10-1000 ml) Ογκομετρικές φιάλες (50-1000 ml) Σιφώνια (πιπέτες), βαθμονομημένα, πληρώσεως(1-20 ml) , Σιφώνια Pasteur Δοκιμαστικοί σωλήνες, κωνικά φιαλίδια φυγοκέντρου (ή πλαστικά) Ύαλος ωρολογίου Ράβδοι Χωνιά Διαχωριστικές χοάνες Προχοίδες Κολώνες χρωματογραφίας στήλης

Γυάλινα σκεύη για ογκομέτρηση Ακριβής ογκομέτρηση Προχοΐδες: Σιφώνια: Ογκομετρικές φιάλες:

Παράδειγμα χρησιμότητας: Τιτλοδότηση Είναι η διαδικασία κατά την οποία μετράμε τον όγκο ενός διαλύματος γνωστής συγκέντρωσης (οξέος ή βάσης) που καταναλώνεται κατά την πλήρη αντίδρασή του με ένα ορισμένο όγκο διαλύματος άγνωστης συγκέντρωσης (βάσεως ή οξέος ανάλογα). Χρήση κατάλληλου δείκτη αλλαγής pH. Πχ. Φαινολοφθαλεϊνη. Άχρωμη σε όξινο pH, ροζ σε βασικό. Το σημείο που επιτυγχάνεται πλήρη εξουδετέρωση, ονομάζεται ισοδύναμο σημείο.

Διαδικασία τιτλοδότησης

Γυάλινα σκεύη για ογκομέτρηση Ογκομετρικοί κύλινδροι, (χωρητικότητας 10-1000 ml) Προσεγγιστική ογκομέτρηση Ποτήρια ζέσεως, (χωρητικότητας 50-2000 ml) Κωνικές φιάλες Ανάδευση ή θέρμανση υγρών.

Πορσελάνινα σκεύη Κάψες εξατμίσεως Γουδιά λειοτρίβησης Χρησιμοποιούνται για την εξάτμιση ενός διαλύματος ή τη συμπύκνωσή του. Για να τις θερμάνουμε, τις τοποθετούμε πάνω σε πλέγμα αμιάντου, υδρόλουτρο ή αμμόλουτρο. Θραύση και άλεσμα στερεών ουσιών

Πλαστικά σκεύη Υδροβολείς Σωλήνες Eppendorf Αυτόματες πιπέτες

Μεταλλικά σκεύη Σπάτουλες Λαβίδες Στηρίγματα Λύχνος Bunsen Ψήκτρες

Πώς φτιάχνουμε διαλύματα με συγκεκριμένη συγκέντρωση διαλυμένης ουσίας Περιεκτικότητα στα εκατό κατά βάρος (% w/w) g διαλυμένης ουσίας σε 100g διαλύματος Περιεκτικότητα στα εκατό βάρους κατ’ όγκον (% w/v) g διαλυμένης ουσίας σε 100mL διαλύματος Περιεκτικότητα στα εκατό όγκου σε όγκο (% v/v) mL διαλυμένης ουσίας σε 10mL διαλύματος Συγκέντρωση ή μοριακότητα κατ' όγκο διαλύματος Η μοριακότητα κατ' όγκο ή συγκέντρωση ή Molarity, εκφράζει τα mol διαλυμένης ουσίας που περιέχονται σε 1 L διαλύματος. Δηλαδή, έχουμε: C=n/V Ας μην ξεχνάμε ότι n=m/Mr Όπου m: μάζα ουσίας σε g Mr: Μοριακό βάρος ουσίας όπου, c = η συγκέντρωση του διαλύματος n = o αριθμός mol της διαλυμένης ουσίας και V = ο όγκος του διαλύματος σε L Μονάδα της συγκέντρωσης είναι το mol L-1 ή Μ.

Ασκήσεις Πώς θα παρασκευάσετε ένα διάλυμα NaCl 15% w/v Πώς θα φτιάξετε ένα διάλυμα KCl 0.1Μ και όγκου 500mL;

Ασκήσεις Να συμπληρώσετε τον παρακάτω πίνακα: Διάλυμα Όγκος (V) Να συμπληρώσετε τον παρακάτω πίνακα: Διάλυμα Όγκος (V) Μάζα (m) Δ/μα NaCl 15% w/w 200g Δ/μα ζάχαρης 20% w/v 200mL Δ/μα CuSO4 0.1Μ (ΜΒ:249,5) 100mL Δ/μα KMnO4 0,1M (ΜΒ: 158)

Αραίωση διαλύματος CαρχVαρχ=CτελVτελ Όταν σε ένα διάλυμα προσθέσουμε νερό, η ποσότητα της διαλυμένης ουσίας παραμένει σταθερή, ενώ ο όγκος του διαλύματος μεγαλώνει. Συνεπώς, το τελικό διάλυμα έχει μικρότερη συγκέντρωση από το αρχικό. Κατά την αραίωση ισχύει η σχέση: CαρχVαρχ=CτελVτελ όπου, Cαρχ καιVαρχ και η συγκέντρωση και ο όγκος του διαλύματος, αντίστοιχα, πριν την αραίωση και Cτελ και Vτελ η συγκέντρωση και ο όγκος του διαλύματος, αντίστοιχα, μετά την αραίωση

Ασκήσεις Πώς θα παρασκευάσετε τα παρακάτω διαλύματα για τελικό όγκο 100mL; Δίνεται ότι αρχικά διαλύματα εμπορίου είναι: H2SO4 98% w/w (18,4M) HCl από 38% w/w (12,4M)

Εργαστηριακές Συσκευές Οι πιο κοινές είναι: Υδατόλουτρο Κλίβανος, Ξηραντήρας Πεχάμετρο Ζυγός Φυγόκεντρος Ανακινητής Φασματοφωτόμετρο Συσκευές χρωματογραφίας, ηλεκτροφόρησης Αυτόματος αναλυτής

Συσκευές μέτρησης ιόντων και αγωγιμότητας Οξυγονόμετρο

Ζυγοί Προσδιορισμός μάζας ενός σώματος Ακρίβεια ζύγισης που φθάνει συνήθως το 0,0001 g (0,1 mg). Τρόπος μέτρησης: μηδενίζουμε τον ζυγό, τοποθετούμε το αντικείμενο προς ζύγιση πάνω στον δίσκο του ζυγού, κλείνουμε τις θύρες του θαλάμου και διαβάζουμε τη φωτεινή ένδειξη της μάζας. Οι συρόμενες θύρες του γυάλινου θαλάμου έχουν σκοπό να προφυλάσσουν τον ζυγό από τη σκόνη και να μην επιτρέπουν να επηρεάζεται η ζύγιση από ρεύματα αέρος. Η ακρίβεια ανάγνωσης κυμαίνεται από 0,1 μέχρι 0,001 g (100 έως 1 mg). Τρόπος μέτρησης: μετά τον μηδενισμό της ένδειξης του ζυγού, τοποθετούμε το προς ζύγιση αντικείμενο πάνω στον δίσκο του ζυγού και διαβάζουμε τη φωτεινή ένδειξη της μάζας.

Πως χρησιμοποιείται ένας αναλυτικός ζυγός

Συσκευές φυγοκέντρησης Φυγόκεντρος: συσκευή με την οποία επιτυγχάνεται επιλεκτική καθίζηση στερεών υλικών (πχ.κύτταρα) ή μακρομορίων (ίζημα) από το υγρό του διαλύματος (υπερκείμενο). Η περιστρεφόμενη κεφαλή με τους υποδοχείς των δειγμάτων ρυθμίζεται να περιστραφεί με συγκεκριμένο αριθμό στροφών/λεπτό και λόγω της μεγάλης συχνότητας περιστροφής, αυξάνει σημαντικά τη δύναμη που ασκείται πάνω στα σωματίδια του ιζήματος, με αποτέλεσμα αυτά να καθιζάνουν ταχύτατα Κλασσική φυγόκεντρος Υπερφυγόκεντρος

Αρχή λειτουργίας φυγοκέντρησης Ο διαχωρισμός των συστατικών ενός μείγματος κατά την φυγοκέντρηση επιτυγχάνεται με την περιστροφή του υλικού σε υψηλή ταχύτητα. Η επιβαλλόμενη φυγόκεντρος δύναμη ωθεί βαρύτερα υλικά προς τα κάτω.

Πώς χρησιμοποιείται μια φυγόκεντρος Επιλογή σωστού ρότορα Σωστό ισοζύγιο Αντιδιαμετρική τοποθέτηση Επιλογή σωστών στροφών/min

Φωτόμετρα Φασματοφωτόμετρο Χρησιμοποιείται για την μέτρηση της συγκέντρωσης ουσιών μέσα σε ένα υγρό διάλυμα. Tο φως που παράγεται από ένα λαμπτήρα κατευθύνεται με μία ορισμένη ισχύ (Po) προς ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει μία ουσία σε ορισμένη συγκέντρωση (g/lt). Το υδατικό διάλυμα απορροφάει τμήμα της προσπίπτουσας ακτινοβολίας και έτσι η ακτινοβολία που απομακρύνεται από αυτό έχει ισχύ P μικρότερη από την αρχική Po. Όσο πυκνότερο είναι το διάλυμα τόσο περισσότερη ακτινοβολία απορροφάται .

Τα βασικά μέρη ενός φασματοφωτόμετρου 1. Η λυχνία παραγωγής φωτός (εκπομπέας φωτός). Χρησιμοποιούνται διάφορες λυχνίες ανάλογα με το φάσμα του φωτός (UV, Vis, IR) που θέλουμε να παράγουμε (προσπίπτουσα ακτινοβολία Po). 2. Το όργανο παραγωγής μονοχρωματικής ακτινοβολίας. Όπως είπαμε η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που θα διέλθει από το διάλυμα πρέπει να έχει συγκεκριμένο μήκος κύματος τέτοιο ώστε να απορροφάται από την ουσία που θέλουμε να μετρήσουμε. Αυτό επιτυγχάνεται με χρήση ειδικών οργάνων όπως είναι οι α) μονοχρωμάτορες, β) φίλτρα γ) πρίσματα και δ) φράγματα περιθλάσεως. 3. Κυψελίδες. Oι κυψελίδες είναι μικρά γυάλινα κυλινδρικά ή ορθογώνια σωληνάρια μέσα στα οποία τοποθετείται το διάλυμα που θέλουμε να μετρήσουμε. Είναι συγκεκριμένου πάχους και διαμέτρου και κατασκευάζονται από διάφορα υλικά (όχι μόνο γυαλί) ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο μήκος κύματος. Οι κυψελίδες πρέπει να διατηρούνται σχολαστικά καθαρές αφού η παραμικρή ακαθαρσία θα επηρεάσει σημαντικά την μέτρηση μας. 4. Φωτοκύτταρο (ανιχνευτής φωτός). Είναι το όργανο που μετράει την ακτινοβολία που διέρχεται μέσα από το διάλυμα.

Αρχή λειτουργίας φασματοφωτόμετρου

Φάσμα φωτός Για τη μέτρηση της απορρόφησης μιας ουσίας χρησιμοποιείται συγκεκριμένο μήκος κύματος. Το φάσμα του φωτός που αξιοποιείται στα ιατρικά εργαστήρια μπορεί να διαιρεθεί σε τρεις περιοχές: 1.Στην υπεριώδη περιοχή (ultravioletή U.V.) που είναι αόρατη στο μάτι, με μήκος κύματος 185-380 nm. 2.Στην ορατή περιοχή (visibleή Vis) που είναι ορατή στο μάτι, με μήκος κύματος ακτινοβολίας 380-780nm. 3.Στην υπέρυθρη περιοχή (infraredή I.R.) που είναι αόρατη στο μάτι, με μήκος κύματος ακτινοβολίας 780 nm. Τα πιο συνηθισμένα φασματόμετρα που συναντώνται στα ιατρικά εργαστήρια είναι τα φασματοφωτόμετρα ορατής-υπεριώδους ακτινοβολίας που χρησιμοποιούν τα μήκη κύματος 180-780nm.

Nόμος των Lambert-Beer Το φως που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο επιλέγεται να έχει συγκεκριμένο μήκος κύματος ή έστω να ανήκει να ανήκει σε ένα συγκεκριμένο εύρος. Αυτό το μήκος κύματος αντιστοιχεί σε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που απορροφάται από τα μόρια της ουσίας την οποία θέλουμε να μετρήσουμε. Στην πράξη κάθε ουσία έχει το δικό της μέγιστο απορρόφησης του φωτός που αντιστοιχεί σε συγκεκριμένο μήκος κύματος το οποίο οφείλουμε να γνωρίζουμε όταν θέλουμε να μετρήσουμε την συγκέντρωσή της. Η απορρόφηση του φωτός (Α) και η συγκέντρωση της ουσίας (C) συνδέονται με την παρακάτω σχέση (νόμος των Lambert-Beer). A= abC Όπου: C: η συγκέντρωση της ουσίας σε g/lt b: το μήκος διανυθείσας διαδρομής μέσα στο διάλυμα (στην πράξη αντιστοιχεί στο πάχος της κυψελίδας που είναι συνήθως 1 cm) α: σταθερά αναλογίας η οποία ονομάζεται απορροφητικότητα.

Nόμος των Lambert-Beer Τα μεγέθη bκαι α σε κάθε μέτρηση στο φασματοφωτόμετρο είναι σταθερά με αποτέλεσμα η απορρόφηση Α να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης C

ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΗΣ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΗΣ ΚΑΜΠΥΛΗΣ Πειραματικά για να μπορέσουμε να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση μιας ουσίας στο διάλυμα πρέπει πρώτα να σχηματίσουμε την πρότυπη καμπύλη της ουσίας αυτής. Φωτομετρούμε μία σειρά από διαλύματα που περιέχουν όλα την ίδια ποσότητα αντιδραστηρίων, αλλά συνεχώς αυξανόμενες γνωστές ποσότητες της ουσίας που μετράμε. Ο τελικός όγκος πρέπει να είναι πάντα ίδιος. Η μέτρηση αρχίζει πάντοτε με τη φωτομέτρηση του «τυφλού», όπως ονομάζεται το διάλυμα που περιέχει όλα τα αντιδραστήρια εκτός της ουσίας. Το «τυφλό» επομένως έχει συγκέντρωση ουσίας (0) μηδέν. Αφού πάρουμε τις αντίστοιχες τιμές του Α για τα γνωστά διαλύματα της ουσίας, σχεδιάζουμε τη γραφική παράσταση της απορρόφησης (άξονας ψ)συναρτήσει της συγκέντρωσης της διαλυμένης ουσίας που απορροφά (άξονας χ). Με την πρότυπη καμπύλη έχουμε τώρα τη δυνατότητα να προσδιορίσουμε οποιαδήποτε άγνωστη συγκέντρωση της ουσίας αν γνωρίζουμε την απορρόφηση του διαλύματος της.

Ποσοτικοποίηση πρωτεΐνης με την μέθοδο Bradford

Κατασκευή πρότυπης καμπύλης Bradford Α Τιμές για πρότυπη καμπύλη. 595nm (μg/mL C(μg/μL) Η γραμμική εξίσωση είναι y=0,052x+0.015 Και επειδή R2>0.98 είναι αποδεκτή.

Από τη γραμμική εξίσωση y=0,052x+0 Για παράδειγμα φωτομετρούμε το προς μελέτη δείγμα στα 595nm και έχει OD = 0,525 Στην παραπάνω εξίσωση βάζω y=0,525 και λύνω ως προς χ που αντιστοιχεί στα mg/mL πρωτεΐνης. χ=0,525-0,015/0,052=9,8μg/μL

Προϋποθέσεις νόμου Lambert-Beer 1) Ο μόνος μηχανισμός αλληλεπιδράσεως ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και της διαλυμένης ουσίας είναι η απορρόφηση 2) Η προσπίπτουσα ακτινοβολία είναι μονοχρωματική. 3) Η απορρόφηση γίνεται σε έναν όγκο διαλύματος ομοιόμορφης διατομής. 4) Τα σωματίδια που απορροφούν δρουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο και άσχετα προς τον αριθμό και το είδος τους.