CURS OPTIONAL 3

GENETICA IN INFARCTUL DE MIOCARD

Genetica IMA 1.Transmitere monogenica -Hipercolesterolemia familiala( status heterozigot)- frecventa:1/200 Implicate 700 mutatii cu penetranta incompleta -Boala Tangier-transmitere autozomal recesiva(alterarea metabolismului lipoproteinelor cu acumulare de esteri ai colesterolului) 2.Transmitere non-monogenica –gene candidate-manifeste in context de mediu

Gene de predictie in IMA Apolipoproteina E(apoE) ε3/ ε4 corelata cu nivelul de LDL colesterol Beta- fibrinogen PAI 1(inhibitor al activatorului plasminogenului) IL-6 Factorul V Leiden asociat cu TVP nu cu modificari arteriale-statistic insa se asociaza cu mutatii HF si cu rezistenta la tratamentul anticoagulant( varianta homozigota)

Gene de predictie in IMA-GWAS 1p36.3 MTHFR Methylenetetrahydrofolate reductase C677T TT 40 (11,162) 1.14 (1.01-1.28) [70] 1q23 F5 Factor V Leiden R506Q Q+ 20 (5,313) 1.10 (0.88-1.36) [69] 1q42.2 AGT Angiotensinogen Met235Thr (M235T) TT 21 (4,001) 1.19 (1.10-1.30) [64] 2p24-p23 APOB Apolipoprotein B Gln4154Lys (Q4154L) LL 14 (1,796) 1,73 (1.19-2.50) [75] 2p24-p23 APOB Apolipoprotein B Signal peptide Ins/Del DD 22 (6,007) 1.19 (1.05-1.35) [75] 7q21.3 PON1 Paraoxonase Q192R R192 44 (10,106) 1.12 (1.07-1.16) [65] 7q21.3-q22 PAI-1 Plasminogen activator inhibitor type 1 5G/4G 4G4G 7 (2,813) 1.20 (1.04-1.39) [73] 7q36 NOS3 Nitric oxide synthase 3 Glu298Asp (E298D) DD 14 (6,036) 1.31 (1.13-1.51) [74] 8p22 LPL Lipoprotein lipase Ser/Ter (S447X) X+ 4 (2,252) 0.80 (0.7-1.0) [66] 11p11 F2 Prothrombin G20210A A+ 19 (4,944) 1.21 (0.99-1.58) [71] 16q21 CETP Cholesteryl ester transfer protein TaqIB B2B2 7 (7,681) 0.78 (0.66-0.93) [72] 17q21.32 ITGB3 Platelet glycoprotein IIIa PL(A1/A2) A2+ 34 (6,173) 1.13 (1.02-1.26) [67] 17q23.3 ACE Angiotensin I converting enzyme Insertion/Deletion DD 43 (14,292) 1.22 (1.11-1.35) [67] 19q13.2 APOE Apolipoprotein E E2, E3, E4 e4 48 (15,492) 1.30 (1.18-1.51) [68]

IMA boala multifactoriala Predispozitia genetica se asociaza cu “dependenta de context” si interactia genica pentru Obezitate Fumat Diabet zaharat Dislipidemie Hipertensiune arteriala Stres Factori etnici

Implicatii genice in risc Fumatul creste de 2 ori riscul de IMA Se asociaza cu APOE-ε 4 Studiul Framingam-descendentii studiului fumatori detinatori de APOE- ε 4 au avut de 2 ori mai crescuta incidenta de IMA decat nefumatorii APOE- ε 3 efect protector Consumul de alcool-consumul zilnic moderat stimuleza ADH gama 1 cu efect vasodilatator si antioxidant si crestere de HDL -colesterol

. Genetic loci identified through genome-wide association studies for coronary artery disease and myocardial infarction are noted. Other loci, e.g. chromosome 6, harbour several genes.

Figure 3 Chromosome 9p21.3 and family history for myocardial infarction. Each risk allele from this locus increases the risk of myocardial infarction by a factor of about 1.3 or 30%, irrespectively whether the family history is positive or not.

Chromosom 9 A.Identification of MEFA2A mutation P279L in coronary artery disease (CAD) patient GB00305. (B) Structure of MEF2A protein with CAD/myocardial infarction-

GENE de prognostic 1.Moarte subita-prin fibrilatie ventriculara ( Bezzina et al). GWAS pe un lot de 972 pacienti cu IMA dintre care 515 au facut fibrilatie ventriculara S-a obiectivat o asociere semnificativa intre SNP rs2824292 pe chromosome 21q21 si fibrilatia ventriculara, Alelele de susceptibilitate sunt in vecinatate genei CXADR, care codifica virusul Coxackie si adenovirus receptor protein implicate si in raspunsul la blocada β-adrenergica Intr-o perspectiva farmacogenetica, pe un studiu cu 735 pacienti cu IMA terapia betablocanta a oferit rate diferite de supravietuire corelate cu mutatii la nivelul cromozomului 21.

GENE de prognostic 2.Examinarea a 95 polimorfisme din 69 gene distincte pe un lot de 2234 pacienti, de etnie diferita, nu a decelat un genotip de susceptibilitate privind supravietuirea post- infarct miocardic acut (Morgan & al-2014). Prognosticul este dependent de asocierile patologice si cumulul de factori de risc Acest aspect limiteaza terapia personalizata care trebuie sa acopere cele 2 cauze( genetice si rezistenta la terapie) .

CONCLUZII Studiile familiale si pe gemeni au evidentiat ca IMA are agregare familiala cu debut in descendenta mai precoce .Genele responsabile de hipercolesterolemie familiala si boala Tangier sunt prototipuri de transmitere monogenica a IMA. . Studiile GWAS au decelat gene candidate si de susceptibilitate ce pot explica aparitia IMA cu componenta familiala indiferent de etnie Studii independente GWAS deceleza un risc major la prezenta unui SNP pe cromozomul 9p21.3 in special la populatia alba In plus unele studii GWAS au identificat SNP asociate cu IMA cu localizare pe diferite locusuri

Terapie genica Factorul de crestere( GF)inductor de angiogeneza si arteriogeneza Initial un proces fiziologic- ocluzia progresiva vasculara redirectioneaza sangele spre colateralele mici cu cresterea consecutiva a calibrului la acest nivel si ingrosarea tunicii musculare Capacitatea individuala de modificare vasculara este variabila participand diferit la progresia bolii. Lipsa de aport sanghin la nivel tisular, datorata ocluziei, creeaza un mediu hipoxic care va conduce la expresia unor factori de crestere precum VEGF si factorul de crestere fibroblastica Consecutiv se initiaza procesul de angiogeneza si arteriogeneza limitat insa de comorbiditti precum diabetul , hipercolesterolemie, disfunctie endoteliala dar si de varsta. Acesti pacienti sunt neeligibili pentru revascularizare Genele ce codifica factorul de crestere pot fi integrate non viral folosind plasmide sau vectori de initiere.

Factorul de crestere Atat dezvoltarea colateralelor cat si angiogeneza sunt tinte pentru terapia IMA . Este un proces benefic in ocluzile multiple si severe dar si ca tratament preventiv post IMA pentru imbunatatirea functiei contractile. Angiogeneza creste perfuzia locala precoce post infarct si permite salvarea miocardului hibernant

Factorul de crestere Terapia genica permite supraexpresia factorilor naturali si intensifica procesul de angiogeneza. Un alt beneficiu posibil ar fi sa prepare patul vascular prevenind ocluzia coronara completa.Acest beneficiu ajuta pacientii cu leziuni severe ocluzive. Nivele scazute de expresie a factorului de crestere a- la- long ar produce un raspuns sustinut optimal.

Factorul de crestere sau vectorul de transfer pot fi injectate intracoronarian via cateter de angiografie Abordarea intracoronarina este simpla, nu necesita echipment special sau medici supraspecializati si nu presupune o alta abordare invaziva cu exceptia angiografiei .De obicei scopul abordarii transcoronariene este de transfer al celulelor endoteliale. Astfel beneficiu este evaluat pe studii mici , fara succes clinic evident Desi administrarea intravenoasa sau intrarteriala este o tehnica simpla proteina VEGF recombinta s-a dovedit ineficienta la fel ca cea intracoronriana deoarece depinde de efectul primei treceri, endoteliul fiind o bariera pentru ambele proteine precum si pentru particulele virale. Administrarea intrapericardica s-a dovedit total ineficienta. Transferul genic intramiocardic in zona de infarct in timpul manevrelor de revascularizare. Studiile clinice ( numar mic de pacienti) au aratat o eficienta mica-moderata la 4-6 luni postinjectare pe functia contractila. .

LIMITE TERAPEUTICE Terapia virala si non-virala este grevata de reactii adverse severe in vivo: 1.Doze crescute de plasmide produc necroza si inflamatie 2.Multe virusuri induc reactie imuna, ce poate conduce la manifestari clinice sau chiar soc septic. 3.Vectorii integrati in genomul gazda pot activa oncogene , pot interfera cu transcriptia normala sau chiar sa induca mutatii in genomul gazda

TERAPIA GENICA MEDIATA DE ULTRASUNETE SI MICROTUBULI (UDMT) Este o potentiala tinta-specifica terapiei genice cu abilitate crescuta in transfectie genica Microtubulii pot contine lipide, albumine, zaharuri, polimeri si alte materiale folosite uzual ca agenti de contrast ultrasonografici datorita proprietatii de a reflecta ultrasunetele. Microtubulii se contracta / se dilata sub efectul ultrasunetelor sau chiar se rup sub efectul sunetelor inalte ceea ce se poate asocia cu diferite efecte biologice .Mecanismul de transfer genic intracelular se bazeaza pe raspunsul specific al microtubulilor la expunere ultrasonografica- SONOPORATIE Prin ruperea microtubulilor sub efectul ultrsunetelor vectorul de terapie genica incorporat in microtubuli poate fi eliberat in concentratii mari la locul de interes .

UDMT Avantaje (1) toxicitate scazuta (2)imunogenitate scazuta a vectorului (3) se pot injecta intravenos fara efecte locale (4) posibilitatea de repetabilitate (5) organele pot fi tintite cu mare specificitate

Microtubulii care transporta genele terapeutice sunt distrusi la locul marcat tisular _ sonoporatie cu eliberare direct in tesut.Procesul de sonoporatie indus de aplicarea US conduce la trecerea transmembranar si transcapilar ceea ce faciliteaza asimilarea genei terapeutice.

Stem Cell Transplant for Treatment of Cardiovascular Diseases Mediate by Ultrasound and Microbubble Procedeul bazat pe terapie celulara prezinta avantajul reabilitarii endoteliale si miocardice postinfarct Dupa infarct migrarea de celule stem la miocardul vital- o metoda terapeutica promitatoare. Iradierea cu ultrasunete induce stimulrea microtubulilor in tesutul interesat iar asocierea celule stem-ultrsunete poate imbunatati eficienta transplantului celular Comparativ cu tesulul non-tinta aderenta de celule stem este mai evidenta la nivel endotelial fara a se observa apoptoza

Aderenta celulelor stem la suprafata endoteliului aortic dupa expunere la US

Terapia cu celule stem Prin definitie, celula stem este capabila sa se autoreproduca generand celule progenitoare ce continua sa se diferentieze in linii celulare mature Celula stem deriva din maduva osoasa nonhematogena avand abilitatea de a se diferentia in osteoblaste, condrocite, miocite, fibroblaste din structura ligamentara precum si adipocite Printr-o stimulare specifica poate sa genereze alte linii celulare: renale , endoteliale sau neurale relevand un mare grad de plasticitate. CSM izolate din diferite surse umane inclusiv maduva osoasa sau cordonul ombilical manifesta o mare capacitate de multiplicare in vivo. Aceaste diversitate de diferentiere este insa rezultatul multiplicarii in linii celulare controlate de microclimatul enzimatic . Sunt usor de analizat pe preparatele in vitro sau culturi celulare deoarece au stabilitate genetica cu accesibilitate la tehnicile de biologie moleculara. Astfel, s-au folosit aceste proprietati pentru a realiza transfectia cu vectori virali in vederea aplicarii strategiilor de studiu clinic. Datorita capacitatii lor de a supravietui mult timp in tesutul tinta s-au folosit modele animale care sa evidentieze rolul lor terapeutic

Terapia cu celule stem Studiile experimentale in vivo arata ca alloCSM nu sunt rejectate si pot avea un efect pozitiv pe grefarea in tesutul gazda . Grefarea in miocard se face fara rejectie imunologica sau infiltrat inflamator chiar in absenta terapiei imunosupresoare Studii experimentale au demonstrat ca expuse le diferiti stimuli fiziologici sau nefiziologici CSM se pot diferentia in diferite varietati de celule cardiomiocite-like cu structura contractila. Functional aceste celule pot produce peptide si exprima multiple proteine structurale si contractile dar pot si transmite potential atrial si ventricular Astfel, diferentierea CSM in celule musculare vasculare sau pericite sau chiar in celule endoteliale a demonstrat implicarea acestora in sistemul vascular atat prin stimulare angiogenica dar si prin vasodilatatie CSM este afinitatea pentru tesuturile afectate sau inflamate. Factorii celulari responsabili pentru migrarea CSM spre focarul de injurie precum si consecintele fiziologice au demonstrat ca CSM participa la procesul de reparare, aspect relevat de experimentele pe fracturi osoase, ischemie cerebrala si infarct miocardic

Terapia cu celule stem Timpul optim de grefare este dependent de cascada inflamatorie indusa de injuria cardiaca. Citokinele proinflamatorii vor regla infiltrarea leucocitara, initierea procesului de fibroza si cresterea sarcinii oxidative si de asemenea, vor modula procesul de angiogeneza, atractia celulor stem si diferentierea. imunosupresibilitatea ce va permite supravietuirea acestora dupa grefare Data fiind cascada inflamatorie ce domina microclimatul postinfarct este foarte important momentul optim de initiere a terapiei cu CSM. De aceea o serie de studii recente opineaza pentru administrarea acestora la o saptamana postinfarct moment de atractie maximala a CSM si o garantie a supravietuirii datorita diminuarii reactiei inflamatorii acute.

Terapia cu celule stem la diabetici Posibilul efect in diabet este sugerat de capacitatea CSM de a genera celule producatoare de insulina(IPC) Aceste celule exprima multiple gene implicate in dezvoltarea si functionarea celulelor beta pancreatice fiind totodata capabile sa elibereze insulina cu ameliorarea hiperglicemiei La diabetic scade activitate MMP2 cu cresterea depozitului de colagen iar MMP 9 este considerat factor proapoptotic fiind implicat in apoptoza celulelor endoteliale,in scaderea perfuziei miocardice precum si in scaderea densitatii capilare. In consecinta se extinde procesul de fibrozare si se autointretine procesul apoptotic Prin eliberarea de factori angiogenici, mitogenici si antiapoptotici (inclusiv VEGF), factor like de crestere insulinic CSM poate induce un important proces angiogen. Un studiu dublu orb, controlat placebo la pacientii diabetici cu infarct de miocard a aratat ca dupa administrarea intravenoasa de CSM autologe creste fractia de ejectie, reduce episoadele de aritmie si cu reduce remodelarea Efecte similare s-au obtinut la pacientii cu arteriopatie periferica diabetica

Terapia cu celule stem- indicatii La pacientii cu ischemie miocardica refractara fara solutie de revascularizare s-a administrat transplantul de BMC transpericardic ( in timpul chirurgiei by-pass) sau transendocardic. Rezultatele au monitorizat parametrii subiectivi precum: frecventa crizelor anginoase sau simptome de insuficienta cardiaca dar si evaluarea perfuziei si functiei contractile. In ischemia miocardica refractara exista o serie de studii de faza precoce. Studiile de faza 1, ce au administrat CSM intravenos la pacientii cu IMA nu si-au dovedit siguranta si eficienta la 6 luni posttransplant deoarece pasajul pulmonar al acestor celule de talie mare poate fi problematic. Exista insa 2 studii la care CSM s-a administrat intramiocardic post IMA si care au relevat o imbunatatire evidenta a FE la 6 luni posttransplant( Chen).

CELULELE STEM Deriva din masa celulara a blastocistului. Pot realiza numeroase diviziuni fara sa se diferentieze. Mentin un set complet de cromozomi Din ele se pot dezvolta celule ce deriva din toate cele trei foite embrionare. Sunt capabile sa se integreze in toate tesuturile fetale pe parcursul dezvoltarii Dintr-o singura celula poate rezulta o linie celulara. Pot fi determinate sa prolifereze sau sa se diferentieze. Le lipseste punctul de control G1. Celulele stem se gasesc de cele mai multe ori in faza S a ciclului celular

Celulele stem sunt cele care păstrează capacitatea de a SURSE DE CELULE STEM Celulele stem sunt cele care păstrează capacitatea de a reproduce celule identice lor, sau care se pot diferenţia în unul sau mai multe tipuri tisulare, în funcţie de factorii de creştere şi de mediul în care sunt cultivate. Clasificări: Din punct de vedere al originii lor: celule stem adulte şi embrionare Din punct de vedere al modului lor de producere, pot proveni: din organe şi ţesuturi adulte, din sângele cordonului ombilical, de la fetuşi rezultaţi în urma întreruperilor de sarcină şi de la embrioni (supranumerari produşi în cadrul fertilizării in vitro, produşi cu scop ştiinţific, produşi prin transfer celular - clonare).

Din punct de vedere al potenţialului se împart în: Totipotente, capabile să permită dezvoltarea unui individ complet şi a anexelor (placentă şi membrane) indispensabile vieţii intrauterine - ovulul fecundat la zigot şi celule embrionare până la stadiul de 8 celule (blastomer). Pluripotente, capabile să formeze toate ţesuturile organismului - celule stem embrionare până la stadiul de blastocit (de la a V-a până la a VII-a zi după fecundare). Acestea nu sunt capabile să formeze placenta şi membranele necesare unei sarcini viabile. Multipotente, prezente la nivelul ţesuturilor fetale sau adulte, pot da naştere mai multor tipuri de celule, dar sunt deja angajate într-un program tisular specific - celule stem hematopoietice din măduva osoasă adultă şi a sângelui de la nivelul cordonului ombilical fetal, care sunt la originea tuturor celulelor sanguine. Unipotente, care nu pot forma decât un singur tip de celule diferenţiate – keratocitele, hepatocitele.

Producerea de celule stem pluripotente umane: SURSE DE CELULE STEM Producerea de celule stem pluripotente umane: Pot deriva din masa celulara a blastocistilor rezultati in urma unor tratamente de fertilizare Pot deriva din tesut fetal (mai intai s-au folosit celule germinale din tesut fetal de soarece apoi au fost izolate celule germinale umane din tesut fetal de 5-9 saptamani) Pot fi obtinute pe calea transferului nuclear in celule somatice (cazul oitei Dolly).

CELULELE STEM Celulele stem embrionare au capacitatea de a se multiplica foarte rapid şi, mai important, de a se diferenţia în toate celulele corpului uman. Celulele stem adulte nu oferă aceleaşi posibilităţi. Ele posedă o capacitate proliferativă limitată comparativ cu celulele embrionare, numărul lor diminuă cu vârsta şi plasticitatea lor este inferioară. Celulele somatice adulte produse la nivelul cordonului ombilical prezintă la rândul lor anumite inconveniente, deoarece sângele este prezent în această zonă doar în cantităţi foarte mici, astfel că numărul celulelor este limitat.

Bolnavul este fie iradiat,fie tratat cu medicatie de supresie medulara PROTOCOL DE ADMINISTRARE CELULE STEM Bolnavul este fie iradiat,fie tratat cu medicatie de supresie medulara Administrarea de celule stem se face intravenos Dupa ce celulele stem sunt transplantate la pacient, vor trece din fluxul sanguin in maduva osoasa cu initierea hematopoezei. Procesul este numit acceptare de grefa si debuteaza la doua-patru saptamani dupa transplantul de celule stem. Supravegherea eficientei transplantului se face periodic Recuperarea completa va fi de lunga durata (luni, ani).

CELULELE STEM Importanta celulelor stem embrionare Descifrarea mecanismelor ce duc la diferentierea celulelor tratarea unor boli grave cum ar fi cancerul, determinate de cresterea si diferentierea anormala a unor celule Testarea medicamentelor pe linii celulare Terapia celulara – tratarea unor boli Parkinson, Alzheimar, boli cardiovasculare, arsuri, diabet, osteoartrita