Diagnosticul de laborator in infectii urinare si genitale Prof. Dr. Olga Mihaela Dorobat

Tractul urinar Organ steril – exceptie uretra Rezista invaziei bacteriene Secretor mucoasa produce mediatori solubili-proteina Tamm-Horsfall adera la pilii bacteriilor/impiedica aderarea IgA Lactoferina restrictioneaza cantitatea de Fe Lipocalin necesara bacteriilor Peptide constitutive/ inductibile- actiune bactericida β defensive - produse de epiteliul renal α defensine – produse de leucocitein cursul inf. urinare cathlicidine – peptide antimicrobiene

Receptori prezenti la suprafata celulelor Raspuns imun celular mediatori ai inflamatiei IL-6 si IL-8 cu actiune chemotactica pentru neutrofile Receptori prezenti la suprafata celulelor TLR4 controleaza producerea de chemokine si citokine TLR2 stimuleaza producerea de TNFα TLR5 recunoaste flagelina bacteriana TLR11 previne infectiile tract urinar Urina – lichide, dieta, medicatie Mediu bun de cultura Bacteriile –aerobe cresc bine anaerobe nu cresc vagin – cresc

Steril- rata scurgerii 0.35ml/min Bacteriile Supravietuire Crestere in urina Aderare la mucoasa Reziste la scurgerea urinii Tract urinar superior Steril- rata scurgerii 0.35ml/min Bacteriile adera – uroepiteliu, pietre Tract urinar inferior – Mediu static de cultura Mucusul inhiba aderarea Descuamarea IgA. IgG – inhiba aderarea

Recoltare Jet mijlociu - Recipient steril –Ø 5cm Instruire toaleta locala Moment –dimineata /3- 4h de la ultima mictiune Inaintea administrarii de antibiotice Nr.probe 1/zi 1-2 la barbat 2-3 la femeie F.subclinice Punga sterila- nn, sugar Punctie suprapubiana –nn, sugari, femei, suspiciune bacterrii anaerobe Cateter – reduce riscul contaminarii probei bolnavi neooperanti…. Cateter permanent - Nu din punga, cu seringa din sonda

PRELUCRARE IMEDIATA max 2h PASTRARE – 40C Consevare – acid boric – 24 h la TC Urocultura Metoda ansei calibrate Calibrare anse 0,01ml Ø 5mm Din 0,1 ml 10 anse 0,001 ml Ø 2,5 mm 100 anse Dilutii - 0,1 din dil. 1/10 CLED ± gel sange  

*European Urinalysis Guidelines Examen microscopic I Urina necentrifugata - camera de numarat Nr.leucocite /μl sau mm3 Nr.hematii /μl Piurie ≥ 10 leucocite/ mm3 10x106 leucocite/l * Centrifugare – se pierd 20 - 80% celule Frotiu colorat Gram – 0,001 ml Ø 2,5 mm 1 bacterie/camp >105 UFC/ml 1 leucocit/camp Piurie *European Urinalysis Guidelines

Examen microscopic II Celule epteliale –scuamoase –marker –tehnica recoltare necoprespunzatoare Exceptie – gravide- crescuta exfolierea celulelor epiteliale Celule epiteliale mici rotunde Celule urotheliale Celule epiteliu tubular renal greu de deosebit indica leziune renala

Citire - interpretare Limita – bacteriurie semnificativa se bazeaza: Simptome clinice Specie bacteriana Numarul de specii izolate Metoda de recoltare Sex Infectii tract urinar necomplicate majoritatea o specie Flora normal din uretra/org.genitale - contaminanti

Interpretarea cantitativa a cresterii Volum inocul (ansa ) Nr.colonii pe placa Nr. colonii in urina (CFU/ml) 1μl (Ø 2,5 mm) 1 103 10 104 100 105 10μl (Ø 5 mm) 102

Citire - interpretare > o specie- interpretarea conditionata: Daca o specie este dominanta Cum a fost recoltata - jet mijlociu / cateter cronic Prezenta de leucocite / celule epiteliale Simptome clinice Istoric Infectie adevarata cu 2-3 specii poate aparea A se repeta - purtători sondă Trei sau > specii - de obicei se raporteaza “cultura mixta”

Citire - interpretare Interpretare Kass 1957 - 95% femei cu pieleonefrita ≥ 105 UFC/ml Pozitiv specificitate > sensibilitate < Femei - Infectii acute simptomatice -o singura specie >102 –104 UFC/ml + piurie + răspuns terapeutic ≥ 103 UFC/ml specificitate > sensibilitate > <105 UFC/ml – fara simptome obisnuit contaminare Barbaţi ≥ 104 UFC/ml > sensibilitatea fără sa < specificitatea Infectii acute necomplicate Infecţii complicate ≥105 UFC/ml

*Buiuc D, Negut M- Tratat de microbiologie clinica –ed II Citire - interpretare Pielonefrita – 80% ≥ 105 UFC/ml 10-15% 104 - 105UFC/ml Bacteriurie asimptomatica 2 probe ≥ 105 UFC/ml Levuri < 103 UFC/ ml C.albicans* 104 UFC/ml Stafilococi* – 5.104UFC/ml Identificare / antibiograma – clasic/ automat Rezultat 48h / 24h Neconcordanta frotiu/cultura –incubare -48h *Buiuc D, Negut M- Tratat de microbiologie clinica –ed II

Cauze posibile pentru o concentratie scazuta de bacterii* Stadiul initial al infectiei Diureza mare Simptome urgente (timp scurt de incubatie in vezica) Prezenta antibioticelor in urina pH-ul scazut al urinii Crestere bacteriana inceata Proba contaminata *European Urinalysis Guidelines

Bacteriurie Simptome Piurie Colonizare + - Infectie asimptomatica Infectie simptomatica Inflamatie fara infectie Simptome fara infectie

METODE ALTERNATIVE I Sistemul Dipslide 2 medii CLED /Mac Conkey……. Sensibilitate 92-95,5%, specificitate 97,2-100% Corespunzator pentru ID Gram negativi E.coli Probleme legate de ID Enterococi, stafilococi – S.saprophyticus Unele sp.Pseudomonas nu cresc Probleme legate de cantitate Inoculul nu este reproductibil Numaratoarea nu este sigura La concentratii mari crestere conflenta – necesita subcultivare

METODE ALTERNATIVE II Medii cromogene – rezultat la 24 h-identificare Enterococcus E.coli P.mirabilis

METODE ALTERNATIVE III Multistix– 8 parametri – Leucocite – activ. esterazică -decelare >10 leucocite/ml Nitraţi – maj. patogeni reduc nitraţii – nitriţi 106UFC/ml Neg. - streptococi, enterococi Impreună – sensibilitate 79% Specificitate Leucocite 87%, Nitrati 100% Proteine Sange Glucoza Corpi cetonici pH Densitate 2 min – citire pe urina proaspat emisă

METODE ALTERNATIVE IV Reactia catalazei – 2ml urină + 4 pic. H2O2 10% 2 min. Bule gaz + reactie pozitivă Bioluminiscenţa – adenosin trifosfatul – sensibilitatea 93%, specificitatea 78% Test screening Fals neg. Stafilococi, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas Metode automate Flowcitometrie

Erori in efectuarea uroculturii I Recoltarea din primul jet de urina Recoltare la < 4h de la utima mictiune Recoltarea in recipiente nesterile Trimiterea unei probe din toata cantitatea de urina Pastrarea > 2 h la TC pana la prelucrare Utilizarea de medii lichide Utilizarea urinii centrifugate pentru insamantare Folosirea de anse cu calibru neverificat Culturi de rutina pentru bacterii anaerobe

Erori in efectuarea uroculturii II Utilizarea de sisteme miniaturizate cu suprafete mici de medii gelozate care nu permit obtinerea unui numar suficient de colonii Efectuarea sistematica a antibiogramelor din direct din urina Neincubarea placilor necrescute la 24h timp de 48h in conditiile in care s-au observat bacterii / leucocite la ex.microscopic direct Necorelarea nr/ml si a felului bacteriilor cu starea clinica a bolnavului

PIELONEFRITA Frisoane Durere lombară Debut - brusc Febră 39-400C oscilantă Frisoane Durere lombară Simptome mictionale - arsuri pot lipsi disurie polakiurie Femei Persoane in vârstă Bărbati - uzual initial prostatita Obstructii –litiaza, apoi inf. urinară Gg, tumori - compresiuni Aderente, stricturi ureter, Reflux vezico-uretral Ex. Urina – leucocite – piurie – nu intotdeauna Lipsa – indiciu localizare –bazinet Fara atingere parenhim renal Ex.gravide - bacterii – E.coli, Proteus, Klebsiella Complemantar – Hemocultura –pozitiva Nr.leucocite >, VSH >, Uree, Creatinina PIELONEFRITA

Infecţii urinare joase CISTITE Urgenţa, frecvenţa Femei în perioada de activ. sexuală Polakiurie 10-20 % cel puţin odată / viaţă Disurie 5 % inf recidivante < 21 zile Dureri suprapubiene aceeaşi bacterie cistalgia reinfecţie > 21 zile Febra – absenta bacterii diferite Diagnostic diferential – inf ginecologice inf digestive

Infecţii urinare joase CISTITE Patogenie Contaminare din apropiere – intestin, genital Incapacitatea de a goli complet vezica Ex. urinii –indispensabil – leucocite ≥ 10 / mm3 bacterii ≥ 105 UFC /ml........... ≥ 103 UFC /ml E.coli  S.saprophyticus Streptococ B Enterococcus Supraveghere – La 2 zile de la oprire tratament 2 - 4 săptămâni pt. depistare recidive

Infecţia urinară la gravide Factori favorizanţi compresie căi urinare dilatare uretere imunodepresie oarecare Frecventă 5-10 % Nu este banală/ benignă Multe asimptomatice Polakiuria confundă Durerea suprapubiană sarcina Risc – copil – n. prematură, hipotrofie fetala inf. neonatale(meningita, sepsis) mama - pieleonefrită

Infecţia urinară la gravide Inf. urinară bine tolerată 6-7 luni - neglijata brusc – tablou grav- 8-9 lună nastere – fat mort mama – soc septic Necesara depistare sistematică Febra - Ex. urină - Hemocultură

Infecţia urinara la copil 0,2% .........5,8% spitalizaţi 0-2 luni (nn) – urmare tulburarilor digestive, fără febră – primele 10 zile > baieţi – malformaţii, megaureter, sindrom de jonctiune, diverticul vezical 2 luni - 6 ani – frecventa > predominant fete febra 50%, tulburari digestive 25% enuresis, falsa albuminurie

Infecţia urinară la purtatori de sondă permanentă Infecţia – 8% - I zi Schimbare – 2 luni – 17% - II zi eroziuni 75% - III zi bacteriemie 100% - IV zi febra - soc Pentru retenţie acută de urină –sonda nu > 48 h Ex. urină – febra - cu o săptămână inaintea schimbării

Infecţia urinară la persoanele in varstă 10 – 20 % Factori favorizanţi Femei – cistocel,diabet, tulburari neurologice reziduu Barbati - adenom prostată, scleroza col vezical vezical Intervenţii chirurgicale Adenocarcinom Polipi vezicali Ureterotomie Extirpare calculi  

Vezica neurologică Malformaţii congenitale – spina bifida Tumori Accidente – secţiune medulară Reziduu vezical asociat Reflux vezico-uretral Favorizează infecţia urinară  Pseudomonas Proteus Insuficienţă renală Pielonefrită E.coli

Izolare patogeni specifici Mycobacterium tuberculosis Recoltare -3 zile - 50ml Centrifugare 15min. 13000g*- Tratare -idem sputa Frotiu Ziehl-Neelsen - Cultivare -Lowenstein Salmonella typhi Jet mijlociu 20ml - centrifugare 3000g 30 min Insamantare selenit - trecere Mac Conkey, SS.. Leptospira Insamantare Korthof cu 200-400 μg/ml fluorouracil/ml – 300C – 30 zile *Buiuc D, Negut M - Tratat de microbiologie clinica –ed II

Secretia uretrala Recoltare –prelucrare ♂ La ≥ 2h după micţiune Scurgere spontana -tampon Fara - se inseră tampon fin alginat/ dacron –2-4 cm se roteşte, se lasă câteva sec., se retrage Pentru Trichomonas – inainte de prima mictiune se imerseaza in 1ml sol salina izotona 370C examinare rapida Pentru ex.microscopic efectuarea frotiurilor si fixare imediat dupa recoltare

Secretia uretrala Recoltare –prelucrare ♂ N.gonorrhoeae insamantare imediata pe placa –mediu la 370C mediu transport Stuart /Amies Chlamydia trachomatis mediu conservant SPG sau 2SP -2ml Congelare -700C  Micoplasme Bulion tripticaz soia 2ml – 40C zile, -700C ani Urina matinala primii 10ml, 100ml WC, 10ml Diferentiere uretrita/cistita

Secretia uretrala Examinare microscopica Frotiu Gram Normal – flora mixta, levuri extracelular Coci Gram negativi intracelular – N.gonorrhoeae Frotiu Giemsa Incluzii Chlamydia trachomatis Preparat proaspat – I proba Trichomonas Geloza chocolat, mediu Thayer Martin - N.gonorrhoeae Incubare atm 5% CO2 ID Testare sensibilitate Cultivare

Secretia uretrala Probe urina Examen macroscopic Filamente mucus –in prima proba sugereaza Examen microscopic Centrifugare 300g – 5 min Sediment –lama/lamela X400 Leucocite ≥15/camp in prima proba indica

Chlamydia trachomatis Diagnostic Chlamydia trachomatis Cultivare ELISA imnunofluorescenta Tehnici moleculare Mycoplasma/ Ureaplasma Seturi comerciale izolare/ identificare (cantitativa) Serologie Mycoplasma genitalium Evidentierea ADN-ului -urina

Studiu 2007 SUA tineri Mycoplasma genitalium depaseste prevalenta gonoreei – devine a 3-a cauza BTS 4,2% Chlamydia 2.3% Trichomonas 1,0 % M. genitalium 0.4 % N. gonorrhoeae Boskey E,  About.com Guide Updated May 24, 2009

Prostatite Probe - dimineata Primii 5-10 ml urina Urina din jetul mijlociu Secretie prostata dupa masaj Primul jet dupa masaj prostata Examen citobacteriologic Cuantificarea bacteriilor – geloza sange + Mac Conkey Prostatita bacteriana – nr.bacterii 10X in proba 3 si 4 ≥ 10 leucocite/camp -marire x400

Prostatite Tuseu rectal orientează Agenti etiologici E.coli 10-20 % Alte enterobacterii – Proteus, Enterococcus Klebsiella S.aureus discutabil – U. urealyticum S. saprophyticus C. trachomatis Prostata Prostatita acuta Edematiata , dureroasa Prostatita cronica Dura, nedureroasa Epididimita Normala, durere discreta

EPIDIDIMITE Clinic Diagnostic – examinare Agenti etiologici tumefiere dureroasa-unulaterala- scrot Scurgere uretrala Iritatie tract urinar Diagnostic – examinare Prelevat de electie – cultura din ureter Prima urina si jet mijlociu Aspirat din epididim sau testicol dupa dezinfectia pielii cu dezinfectant chirurgical Agenti etiologici C.trachomatis N.gonorrhoeae Enterobacteriaceae , Pseudomonas > 35 ani M.tuberculosis

ORHITE Adeseori virale - V.urlian,Coxsakie B, Prelevate intraoperatoriu Examinare Microscopica Cultivare bacterii aerobe Agenti etiologici E coli K.pneumoniae P.aeruginosa Stafilococi Streptococi

Tract genital feminin Superior – steril bacteriologic Inferior – contaminat cu flora –piele / tract digestiv Variaţii Vagin/ cervix Vârsta Ciclul Graviditate Imunodepresie Flora influenţată de estrogeni Nou-nascut –6 săpt- estrogeni de la mamă – lactobacili Pană la pubertate-floră de pe piele - Stafilococi cg. neg, difteromorfi, bacterii / fecale - E.coli Dupa pubertate – predomina lactobacilii Menopauza- lacobacili <, nr.mare enterobacterii

Femeia adulta In absenta infectiei 106-109 bacterii/gram secretie vaginala Frecventa izolarii speciilor Portaj obisnuit Portaj frecvent Portaj exceptional % Lactobacili (Flora Doderlein) >80 Bacili anaerobi (Bacteroides, prevotella, Mobiluncus) 20 Streptococi negrupabili >60 Stafilococi coagulazo-negativi Enterococi >30 S.aureus 10 Candida albicans 30 Mycoplasma hominis <5 Enterobacterii (E coli, Proteus, etc) Pneumococi ≤4 Ureaplasma Haemophilus spp. Gardnerella vaginalis Streptococ grup A Streptococi anaerobi Meningococ <1 Streptococ grup B

Vaginite- vaginoze Recoltare secretie 3 tampoane fund de sac vaginal posterior Prelucrare Tampon 1- in 0,5 ml solutie salina isotona 370C Examinare lama/lamela x100 x400 Trichomonas, levuri inmugurite, pseudofilamente Raportul PNM/ celule epiteliale Reactie inflamatorie Intensa - Trichomonas Discreta – Candidoza Absenta- vaginoza Tampon 2 – Frotiu Gram

Interpretarea frotiu Gram pentru vaginoza bacteriana Numar bacterii/camp microscopic imersie Nugent modificat 4+ = >30 3+ = 6 -12 Interpretare SCOR 2+ = 1 – 5 0 – 3 Flora normala 1+ = <1 4 – 7 Flora modificata 0 = 0 7 -9 Vaginoza bacteriana Morfotip Apreciere cantitativa Scor dupa morfotip 1+ 2+ 3+ 4+ Bacili Gram pozitivi medii si mari 4 3 2 1 Bacili miciGram negativi sau variabili Bacili incurbati Gram negativi sau variabili

Vaginite- vaginoze Tampon 3 Cultivare pentru Candida- Sabouraud cu cloramfenicol sau mediu cromogen La solicitare cultura pentru N.gonorrhoeae S.aureus- in sindromul socului toxic evidentierea toxinei –ELISA, reverse pasive latex agglutination Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes Shigella spp.- fetite Enterobacteriile nu se comunica- fac parte din flora normala a vaginului

Caractere diagnostice pentru vaginite si vaginoza Boala sau conditie pH Observatii la ex. preparat umed Miros de amina Alte teste Normal 4-4,5 Bacili lungi Absent Atrofie >6 Candidoza Pseudohife sau levuri inmugurite Cultura pentru levuri Vaginoza bacteriana >4,5 Clue cells Prezent Coloratie Gram Thricomoniaza 5-6 Paraziti flagelati Prezent in mod obisnuit Cultura Trichomonas Testul Whiff= testul aminelor volatile 10% KOH

Vulva Recoltare-durere, eritem, edem Examinare Curatirea cu sol. 0.85% NaCl Exsudat/ eritem cu tampon –pentru culturi levuri Vezicule – Rupte –colectare lichid cu tampon Aspirat cu seriga cu ac 26-27gauge Cruste – se indeparteaza Tampon umezit sol. 0.85% NaCl Examinare Microscopica – Trichomonas Gram- reactie inflamatorie, bacterii Cultivare – pentru S.aureus, S.pyogenes ……..

Streptococ grup B Evidentiere la gravide s 35-37 gestatie Recoltare - tampon vaginal Metoda de electie Bulion LIM (Todd Hewitt) colistin 10μg/ml, ac nalidixic 25 μg/ml Bulion Trans Vag Trecere pe geloza sange Latex aglutinare Insamantare directa mediu Granada 20-60% dintre pozitivi Necesita atm. anaeroba

Streptococ grup B Dificultati Inhibitia cresterii in prezenta Enterococcus –LIM 2% nu produc hemoliza 3-4% nu produc pigment Clasic rezultatul 48 ore Metode moleculare AccuProbe Cepheid Real time PCR

Glanda Bartholin Recoltare Examinare Decontaminare – povidone/iodine- alt preparat Aspirare din canal Frotiu – in momentul recoltarii Transport rapid in mediu Amies /Stuart Examinare Microscopica- frotiu Gram Cultivare pentru N.gonorrhoeae Enterobacterii (E.coli, Proteus) S.aureus Streptococi Haemophilus Anaerobi Pasteurella bettyae Teste pentru Chlamydia trachomatis, Ureaplasma l

Cervicite Recoltare scurgere mucopurulenta Tampon 1- frotiu Gram Se indeparteaza secretia –exocol –comprese sterile Se introduc tampoanele(3) in endocol 1-2 cm Tampon 1- frotiu Gram Tampon 2 -cultivare N.gonorrhoeae Tampon 3 – C.trachomatis -Frotiu Giemsa – Alte teste Imunofluorescenta ELISA Cultivare Metode moleculare

Isenberg HD- Clinical Microbiology Procedures Handbook Endometrite Recoltare transvaginala prin aspirare Transport in conditii de anaerobioza Examinare Microscopica- Frotiu Gram Cultivare bacterii aerobe si anaerobe Agenti etiologici Actinomycetes Bacteroides spp C. trachomatis Enterococcus spp. E.coli G.vaginalis H.influenzae Klebsiella L.monocytogenes Prevotella S.agalactiae S.pyogenes Isenberg HD- Clinical Microbiology Procedures Handbook

Salpingite Recoltare Aspirat si probe biopsice prin laparascopie Examinare Microscopica- Frotiu Gram Cultivare – bacterii aerobe / anaerobe Agenti etiologici Actinomycetes Bacteroides spp C. trachomatis Enterococcus spp. E.coli H.influenzae N.gonorrhoeae Pasteurella Prevotella S.aureus S.epidermidis S.agalactiae Streptococi

Situatii particulare Daca Proba a fost obtinuta invaziv Se identifica Cultura abundenta predominenta Se identifica Haemophilus spp Bacilii Gram negativi enterici (exceptie enterobacteriile din vagin - Nu se raporteaza) Pseudomonas spp. /alti Gram negativi nefermentativi Pasteurella bettyae – la nn. Capnocytophaga spp. Campylobacter fetus S. aureus S. pneumoniae N. meningitidis G.vaginalis