13.2.KROMATOGRAFIJA Odjel za kemiju Odjel za kemiju

Kromatografiju je izumio ruski botaničar Tswett (Cvet) početkom 20. st. Primijenio je kromatografsku tehniku za odjeljivanje otopine biljnih pigmenata klorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu usitnjenim Ca-karbonatom. Odjeljeni sastojci vide se na koloni kao obojene vrpce po kojima je ta tehnika dobila ime (grč. Chroma = boja) Odjel za kemiju

13.2.1. KROMATOGRAFSKE METODE Definicija i osnovni pojmovi Kromatografija je fizikalna metoda koja se koristi za razdvajanje smjesa kojom se sastojci koji se razdvajaju raspodjeljuju između dvije faze: nepokretne ili stacionarne faze (stationary phase, adsorbent, SP) pokretne ili mobilne faze (mobile phase, eluent, MP) Stacionarna faza: kruta, tekuća (vezana na čvrstom nosaču), gel Mobilna faza plinovita: plinska kromatografija (gas chromatography, GC), tekuća: tekućinska kromatografija (liquid chromatography, LC) Odjel za kemiju

Kromatograf: uređaj za izvođenje kromatografskih razdvajanja Kromatografska kolona: cijev koja sadrži stacionarnu fazu i kroz koju prolazi mobilna faza. Kromatograf: uređaj za izvođenje kromatografskih razdvajanja Kromatogram: grafički prikaz odziva detektora (kromatografske analize) Odjel za kemiju

13.2.1.1. PODJELA KROMATOGRAFSKIH METODA Plošna kromatografija stacionarna faza nanesena je na ravnu plohu ili u pore papira. Mobilna faza prolazi kroz stacionarnu zbog kapilarnih sila ili gravitacije Kromatografija na stupcu stacionarna faza ispunjava usku cijev kroz koju se mobilna faza kreće pod utjecajem tlaka ili gravitacije Odjel za kemiju

tekućina (tanki film otapala na tankom krutom poroznom nosaču PODJELA PREMA AGREGATNOM STANJU FAZA: stacionarna faza mobilna faza krutina tekućina tekućina (tanki film otapala na tankom krutom poroznom nosaču plin mobilna faza stacionarna faza postupak tekućina (liquid, l) krutina (solid, s) LSC LLC plin (gas, g) GSC GLC Odjel za kemiju

PODJELA PREMA FIZIČKO – KEMIJSKIM SVOJSTVIMA ANALITA svojstvo analita mobilna faza: plin (plinska kromatografija) mobilna faza: tekućina (tekućinska kromatografija) vrelište Sve vrste GC _ adsorpcija GSC LSC topljivost GLC LLC oblik molekule GSC s molek. sitima gelna kromatografija afinitetna kromatografija reverzibilna kemijska reakcija GLC uz tvorbu kompleksa kromatografija ionske izmjene Odjel za kemiju

PODJELA PREMA IZVEDBENIM TEHNIKAMA: Kromatografija na papiru PC Kolonska kromatografija CC Plinska kromatografija GC Tankoslojna kromatografija TLC Tekućinska kromatografija visoke razlučivosti HPLC Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

13.2.2. Kromatografska analiza: 1. Unošenje (injektiranje) analita unošenje uzorka u mobilnu fazu 2. Razdvajanje analita u koloni sastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju različite raspodjele između dviju faza 3. Eluacija (ispiranje) komponenti iz kolone različiti sastojci izlaze iz kolone u različitim vremenima 4. Detekcija eluirane komponente obično se analiziraju mjerenjem neke od fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV apsorpcija, električna vodljivost …) Odjel za kemiju

a) TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA (LC) Eluacija – ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu dodavanjem novih količina otapala. Ako je stacionarna faza polarna onda se za mobilnu uzima nepolarna. Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Raspodjela analita između faza Analit se nalazi u ravnoteži između dvije faze: Amobile ⇋ Astationary Konstanta ravnoteže K te reakcije zove se koeficijent raspodjele: cS … molarna analitička koncentracija sastojka u stacionarnoj fazi, cM … molarna analitička koncentracija sastojka u mobilnoj fazi. Odjel za kemiju

Vrijeme zadržavanja (retention time) tR - vrijeme potrebno da analit nakon unošenja uzorka stigne u detektor Mrtvo vrijeme tM - vrijeme potrebno da mobilna faza prođe kroz kolonu Odjel za kemiju

..... Faktor kapaciteta (faktor zadržavanja) (retention factor, capacity factor) za k'A znatno manje od 1  eluiranje je prebrzo, tR teško mjerljivo, za k'A > 20-30  eluiranje je predugo, k'A 1 – 5  idealno Odjel za kemiju

b) KOLONSKA KROMATOGRAFIJA (CC) Tiselius – začetnik kolonske kromatografije 1952. a) punjene kolone materijal: čelik, staklo, teflon duljina: 2-3 m, unutarnji promjer: 2-4 mm punjenje: čvrsti nosač (obično dijatomejska zemlja) na kojem je nanesen tanki sloj stacionarne (tekuće) faze b) kapilarne kolone materijal: danas uglavnom kvarcno staklo duljina: 10-100 m, unutarnji promjer: 0.1 - 0.5 mm punjenje: unutarnje stjenke prevučene samo slojem tekuće stacionarne faze ili nosačem na kojem se nalazi adsorbirana stacionarna faza Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

c) KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC) Odjel za kemiju

identifikacija supstancija, ispitivanje čistoće supstancija. Primjena PC: identifikacija supstancija, ispitivanje čistoće supstancija. Osobine PC: relativno brza metoda, potrebna mala količina materijala. stacionarna faza: visokokvalitetni filter papir mobilna faza: otopina razvijača http://www.youtube.com/watch?v=EUn2skAAjHk Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

d) TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC) E. Stahl - začetnik tankoslojne kromatografije (TLC), 1950 Isti je pricip kao kod papirne kromatografije. Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Tankoslojna kromatografija (Thin layer chromatography (TLC)) Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

e) PLINSKA KROMATOGRAFIJA (GC) Martin i James – začetnici plinske kromatografije (GC), 1952. (Nobelova nagrada) Mobilna faza: - inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni napunjenoj stacionarnom fazom. - Za razliku od tekućinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit ne reagira s mobilnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja kroz kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi mobilne faze. Stacionarna faza: - za odjeljivanje komponenti male molekulske mase: stacionarna faza je čvrsta tvar velike specifične površine na koju se adsorbiraju analizirane komponente, - za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase: stacionarna faza je tekuća faza nanesena na površinu čvrstog nosača adsorpcijom ili kemijskim vezanjem. Odjel za kemiju

Analit: ubrizgava se kao tekućina koja zbog visoke temperature u kromatografu prelazi u plinovito stanje, temperatura ulaza instrumenta postavlja se na 50°C višu temperaturu od temperature vrelišta najslabije hlapljive komponente iz analizirane smjese. Odjel za kemiju

Plinski kromatograf Sastavni dijelovi aparata: Plin nosilac (carrier gas): kemijski inertan (N2 He, Ar, H2) regulirani protok plina Sustav za unošenje uzorka: količina uzorka: 0.1 – 20 μL mjesto unošenja uzorka je grijano (ca. 50°C iznad temp. vrelišta najmanje hlapljivog sastojka Odjel za kemiju

Faze plinsko-kromatografske analize: unošenje uzorka na vrh kolone, transport uzorka mobilnom fazom kroz kolonu, adsorpcija sastojaka u stacionarnoj fazi, detekcija sastojaka. http://www.wooster.edu/chemistry/analytical/gc/default.html Odjel za kemiju

ECD FID Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Plinska kromatografija Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Slika prikazuje sofisticirani plinski kromatografski sustav, koji bilježi koncentraciju akrilonitrila u zraku. Odjel za kemiju

f) TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI (HPLC) Odjel za kemiju

Mobilna faza: tekućina Stacionarna faza: punila vrlo finih zrna Tlak: nekoliko milijuna Pa (do 4 x 107 Pa = 400 bara) - tlačna pumpa, sisaljka Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography): (1) Razdjelna kromatografija (2) Adsorpcijska kromatografija (3) Ionsko-izmjenjivačka kromatografija (4) Kromatografija isključenjem na osnovi veličine čestica (size-exclusion chromatography) Doseg HPLC: najveći u separacijskim tehnikama, proizvodnja > mld USD godišnje Odjel za kemiju

- analiza neisparljivih i termički osjetljivih spojeva, Prednosti HPLC: - osjetljivost, - prilagodljivost, - analiza neisparljivih i termički osjetljivih spojeva, - široki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline, nukleinske kiseline, šećeri, lijekovi, pesticidi, organometalni spojevi, anorganske tvari i dr.) Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Shema HPLC uređaja Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

13.2.3. DETEKTORI Efluent s kolone mješa se s vodikom i zrakom i spaljuje. Organski sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajući ione i elektrone koji mogu provoditi elektricitet kroz plamen. Na vrh plamenika dovodi se visoki električni potencijal, a iznad plamena postavljena je kolektorska elektroda. Mjeri se električna struja izazvana pirolizom organskih sastojaka. Odjel za kemiju

DETEKTORI • Ključni su dio HPLC-uređaja: stalno se usavršavaju • Nema opće primjenljivih detektora (kao FID/TCD) • Zahtjevi: kao kod GC; dodatno: što manji volumen uzorka • Tipovi: (1) prate promjenu svojstava mobilne faze (indeks loma, dielektrična konstanta i dr.), (2) detektori analita (UV, fluorescencija...). • Zastupljenost: 71% UV, 15% fluorescencijski, 5% indeks loma Odjel za kemiju

13.2.3.1. UV/VIS-apsorpcijski detektori • Svojstva: univerzalnost, jednostavnost, selektivnost, osjetljivost - vrlo su rašireni • Načelo: apsorpcija elektromagnetskog zračenja u UV-(170 - 400 nm) i VIS-području (400 - 750 nm) • Lambert-Beerov zakon (za kvantitativnu primjenu): A = Ɛ × b × c Tipični UV/VIS-detektor: volumen 1-10 μl, duljina 2-10 mm, tlak < 40 bar (potrebni reduktori) Odjel za kemiju

13.2.3.3. Detektori s monokromatorima 13.2.3.2. Detektori s filterima - Izvor zračenja: Hg-lučnica iz koje filtar izdvaja λ = 254 nm (odnosno 250, 313, 334 nm) - primjena ograničena. Izvor zračenja: deuterijeva (D2) ili volframova (W) lampa s više filtera (rotirajući) - za serijske analize uzoraka poznata sastava. 13.2.3.3. Detektori s monokromatorima - Prizme ili optičke rešetke (grating) razdvajaju polikromatsko svjetlo na komponente određenih valnih duljina koje se potom djelovanjem pukotine odaberu prema uzorku da bi se snimio cijeli kromatogram. Odjel za kemiju

Alternativa: za svaku komponentu uzorka (ako su dovoljne razlike tR) odabire se najpogodnija λ, uz moguću kompjutorsku podršku - izvor D2-lučnica (190-800 nm), uz izdvajanje putem rešetke (grating) snopova širokih 2-4 nm (starije naprave 20-40 nm) 13.2.3.4. Detektor s nizom dioda (Diode Array Detector) Načelo: osvjetljivanje uzorka polikromatskim svjetlom (“bijelim”) D2-lučnice, a potom disperzija optičkom rešetkom na snopove 2 nm koji istodobno padaju na niz od cca 316 dioda - Cijeli snimak (scan): 0,1 sekunda (u praksi nekoliko sekundi) uz odličnu reproducibilnost. Dobiva se i pohranjuje cijeli spektar svake komponente. Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Mogućnost: 3-dimenzionalni graf A-λ-t za razdvojene steroide u intervalu 5 sekundi Odjel za kemiju

13.2.3.5. Fluorescencijski detektori • Fluorescencija – neke tvari apsorbiraju elektromagnetsko zračenje i pri relaksaciji (prelazak iz pobuđenog u osnovno stanje) emitiraju zračenje više valne duljine λ (često u vidljivom dijelu spektra, VIS) • Ograničeno na fluorescirajuće spojeve (farmacija, prirodni i klinički spojevi,naftni derivati); moguća je pretvorba nefluorescirajućih u fluorescirajuće spojeve! • Izvori elektromagnetskog zračenja: (1) Hg-lučnica (emitirano svjetlo izolira se s filtera) (2) Xe-izvor (monokromatori su optičke rešetke) • Emitirana svjetlost širi se u svim smjerovima pa je fotoelektrični detektor pod 900 prema λ upadne zrake Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

13.2.3.6. Detektori za mjerenje indeksa loma • Svojstva: pouzdanost, neovisnost o protoku, niska osjetljivost, ovisna o temperaturi (opći uređaj poput FID) • Načelo: prisutnost otopljene tvari (solute) mijenja indeks loma mobilne faze (MF) • Naprava: Diferencijalni detektor; u komoru odijeljenu staklenom pločicom s jedne strane prolazi otapalo a s druge eluat. Ploča uzrokuje lom ulazne zrake. Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju

Odjel za kemiju