Základné metódy práce s ľudskou DNA 2005 Katedra molekulárnej biológie

Izolácia DNA DNA - v jadre bunky - v komplexe s bielkovinami Postup: lýza bunkových membrán (SDS) štiepenie proteínov (proteináza K) odstránenie proteínov (fenol/chloroform) vyzrážanie DNA (etanol)

Izolácia DNA kitom Postup: lýza bunkových membrán a štiepenie proteínov naviazanie DNA na kolónu premytie kolóny elúcia DNA precipitácia DNA

Určovanie kvantity a kvality DNA Spektrofotometricky kvantita – OD pri 260 nm (1 OD ~ koncentrácia 50 μg/ml) kvalita – pomer OD pri 260/28nm (ideálne ~ 1,8) Elektroforézou kvantita – porovnaním so štandardom kvalita – určenie degradácie DNA

Elektroforéza DNA

Separačné média pre analýzu DNA Polyakrylamid Separácia jednovláknovej a dvojvláknovej DNA rozdiel vo veľkosti fragmentov od 1 nt Agaróza separácia dvojvláknovej DNA rozdiel vo veľkosti fragmentov od 10nt Koncentrácia agarózy [%] Oblasť efektívneho rozdelenia molekúl DNA [kb] 0,3 60 - 5 0,6 20 - 1 0,7 10 - 0,8 0,9 7 - 0,5 1,2 6 - 0,4 2,0 3 - 0,1 Koncentrácia polyakrylamidu [%] Veľkosť DNA fragmentov v nt 3,5 1000 - 2000 5 80 – 500 8 60 – 400 12 40 – 200 15 25 – 150 20 6 - 100

Vizualizácia DNA v géli EtBr, SYBR Green (agarózový gél, polyakrylamnidový gél) interkalačné činidlo dsDNA UV lampa AgNO3 (polyakrlylamidový gél) ssDNA a dsDNA denné svetlo Fluorescenčné farbičky (genetický analyzátor) kovalentná väzba farbičky na primer ssDNA laser a CCD kamera

Štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami enzýmy súčasťou RM systému baktérií názvy podľa pôvodu 5´prečnievajúce konce, 3´prečnievajúce konce, tupé konce

Elektroforéza DNA po štiepení RE

Príprava rekombinantných DNA

Hybridizácia DNA komplementarita báz Tm (GC content)

Southernov blotting genomická DNA štiepenie RE elektroforéza oligonukleotidová sonda k unikátnej sekvencii

FISH technológia detekcia numerických a štrukturálnych chromozómových aberácií fluorescenčne značené oligonukleotidové sondy fluorescenčný mikroskop

Microarray/ DNA chip Hybridizácia fluorescenčne značenej, testovanej DNA s DNA sondou viazanou na detekčnom sklíčku

DNA microarray a DNA chip možnosti aplikácie technológií DNA microarray a DNA chip

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) Kary B. Mullis - 1993 Nobelova cena

Princíp PCR

Verifikácia PCR amplifikácie

PCR odporúčané nastavenie DNA 50 – 500 ng primery 16 – 24 nt dlhé Tm 48 – 65 ºC GC content 40 – 60 % 1 – 10 pmol/na reakciu dNTP 50 - 500 μM MgCl2 1 – 5 mM DNA polymeráza 0,5 – 2,5 U úvodná denaturácia DNA 94 – 95 ºC 2 – 5 min cyklické opakovanie – 25 - 35 x denaturácia 94 – 95 ºC 30 – 40s hybridizácia T = Tm – 3 ºC polymerizácia 72ºC 45s (do 1 kb) záverečná polymerizácia 72 ºC 7 min Chladenie/inaktivácia reakcie 4 – 10 ºC

Sekvenovanie (Sanger) 1

Sekvenovanie (Cycle sequencing)

Pyrosequencing