14. nedelja: Pitanja za ulazni test 1. Šta su imunodeficijencije i kako se dele? 2. Koje su imunodeficijencije prouzrokovane poremećajima komponenti urođene imunosti (primeri)? 3. Koje su imunodeficijencije prouzrokovane poremećajima T- i B-limfocita (primeri)? 4. Kako se određuje broj pojedinih populacija leukocita u perifernoj krvi? 5. Kako biste u uzorku krvi pacijenta odredili broj, izdvojili i funkcionalno ispitali subpopulacije limfocita (B-ćelije, pomoćničke T-ćelije, citotoksične T-ćelije)? 6. Šta je to protočna citofluorimetrija i kakva je njena primena? 7. Koji su osnovni markeri T-limfocita, B-limfocita i NK ćelija? 8. Kako se indukuje i meri proliferacija T- i B-limfocita? 9. Kako se određuju ukupni imunoglobulini u perifernoj krvi, a kako specifični imunoglobulini za određene antigene? 10. Šta su to provokacioni testovi, kožne probe rane i kasne preosetljivosti (primeri)?

Molimo vas da na sledeći seminar donesete: Popunjen indeks Šifra predmeta: IMUN Naziv nastavnog predmeta: Imunologija Godina: II Status predmeta: O ESPB: 3 Predavanja: 15 Vežbe: 10 Ostalo: 20

Molimo vas da date i komentare Molimo vas da na sledeći seminar donesete: i 2. Popunjenu anketu o nastavi iz Imunologije koja se nalazi odštampana u Priručniku za nastavu iz Imunologije (poslednja strana) Molimo vas da date i komentare

Ispitivanja ćelija imunskog sistema

Ispitivanja ćelija imunskog sistema Izdvajanje ćelija Određivanje broja Funkcionalna ispitivanja in vitro

Izdvajanje MNĆ periferne krvi pomoću gradijenta gustine Mononuklearne ćelije periferne krvi centrifugiranje Limfoprep Gustina 1.077 g/ml Eritrociti i Granulociti

Izdvajanje MNĆ periferne krvi pomoću gradijenta gustine Mononuklearne ćelije periferne krvi centrifugiranje Limfoprep Gustina 1.077 g/ml Eritrociti i Granulociti

Razdvajanje ćelija pomoću paramagnetnih kuglica MACS® Nakon uklanjanja magnetnog polju obeležene ćelije se ispiraju i sakupljaju Heterogena populacija ćelija inkubirana sa antitelima obeleženim magnetnim česticama se nanosi na kolonu od čelične vune U magnetnom polju obeležene ćelije ostaju vezane za kolonu a neobeležene se ispiraju

Određivanje broja ćelija Na osnovu morfologije i bojenja leukocitna formula iz komore i krvnog razmaza Na osnovu veličine i granuliranosti automatski brojači ćelija Na osnovu specifičnih površinskih molekula T-limfociti: B-limfociti: NK ćelije: CD3, CD4, CD8.... Ig, CD19, CD20... CD16, CD56...

Protočni citofluorimetar FACS®

Smeša ćelija obeleženih fluorescentnim antitelima Protočna citofluorimetrija Smeša ćelija obeleženih fluorescentnim antitelima Zelena foto-multiplikatorska cev (PMT) Mlaz tečnosti koji nosi fluorescentno obeležene ćelije Crvena PMT Granuliranost Veličina

Smeša ćelija obeleženih fluorescentnim antitelima Protočna citofluorimetrija Smeša ćelija obeleženih fluorescentnim antitelima Zelena foto-multiplikatorska cev (PMT) Mlaz tečnosti koji nosi fluorescentno obeležene ćelije Crvena PMT Granuliranost Veličina 13

Histogramski prikaz Dot plot prikaz

Protočna citofluorimetrija (klinička primena) Imunofenotipizacija (identifikacija i kvantitiranje populacija i subpopulacija limfocita) Karakterizacija ćelija kod limfoproliferativnih bolesti, tumora i imunodeficijencija Određivanje produkcije reaktivnih oblika kiseonika i azota Određivanje sadržaja DNK (ćelijski ciklus)

Protočna citofluorimetrija (istraživačka primena) Identifikacija aktivacionih molekula (npr. površinski aktivacioni markeri, intracelularni Ca++, fosforilacija intracelularnih proteina) Detekcija specifičnih intracelularnih proteina (npr. citokina) Detekcija i kvantitiranje apoptoze ćelija

Funkcionalna ispitivanja fagocita Hemotaksa Adherencija Ingestija Respiratorni prasak Intracelularno ubijanje

Funkcionalna ispitivanja NK ćelija Citotoksičnost K 562 Produkcija citokina IFN-γ (ELISA)

Citotoksičnost (oslobađanje 51Cr K562) Ispitivanje funkcija NK ćelija Citotoksičnost (oslobađanje 51Cr K562) NK ćelije sa obeleženim ciljnim Obeležavanje ciljnih ćelija sa 51Cr Ubijene ćelije oslobađaju 51Cr

Ispitivanje ćelija stečene imunosti (T i B-limfocita) Određivanje broja ćelija Ispitivanje funkcionalnih svojstava T-ćelija (proliferacija, produkcija citokina, citotoksičnost) B-ćelija (proliferacija, produkcija antitela)

Ispitivanje funkcija T-limfocita Proliferacija Stimulacija: poliklonskim aktivatorima (mitogenima: PHA, ConA) antigenima Meri se inkorporacijom 3H timidina u novosintetisanu DNK

Pacijent medijum ConA A.B. 430±31 43905±389 D.G. 230±84 1200±227

Ispitivanje efektorskih funkcija B i T-limfocita Produkcija antitela (B-limfociti) (Nefelometrija, RID, ELISA) Produkcija citokina (T-limfociti) (ELISA) Citotoksičnost (CTL) (Citotoksični test)

Nakon ovog seminara možete da odgovorite na sledeća pitanja

I Kako se izdvajaju ćelije imunskog sistema? Izdvajanje na gustinskom gradijentu MACS® Protočna citofluorimetrija (FACS®) II Kako se određuju broj i fenotipske karakteristike ćelija imunskog sistema? Diferencijalna leukocitna formula III Kako se ispituju funkcije ćelija imunskog sistema in vitro? Fagociti (hemotaksija, fagocitoza, respiratorni prasak, ubijanje) NK ćelije (citotoksičnost, produkcija IFN-γ ) T-ćelije (proliferacija, citotoksičnost, produkcija citokina) B-ćelije (proliferacija, produkcija antitela)

1. Izdvajanje ćelija iz krvi vrši se na osnovu a. produkcija citokina i citotoksičnost 2. Površinski markeri T-limfocita su b. ELISA 3. Površinski markeri B-limfocita su c. kod obolelih od hronične granulomatozne bolesti 4. Površinski markeri NK ćelija su d. citotoksičnim testom 5. Ubilačka aktivnost NK ćelija se određuje e. razlike u gustini i površinskim markerima 6. Respiratorni prasak fagocita je smanjen f. CD3 i CD4 ili CD8 7. Efektorske funkcije T-ćelija su g. membranski imunoglobulini, CD19, CD20 8. Za merenje nivoa produkcije citokina koristi se h. nefelometrija, RID, ELISA 9. Za merenje količine antitela koriste se i. stimulacijom sa T-ćelijskim mitogenima 10. Proliferacija T-limfocita se ispituje j. CD16 i CD56 10.__ 9.__ 8.__ 7.__ 6.__ 5.__ 4.__ 3.__ 2.__ 1.__ e f g j d c a b h i

Seminar Prikaz kliničkih slučajeva Sledeća nedelja Predavanje Sekundarne imunodeficijencije Seminar Prikaz kliničkih slučajeva