Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας – Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Εργαστήριο Τεχνολογίας οργάνων Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD 18 Ιανουαρίου 2018

Ηλεκτροφόρηση Είναι μια μέθοδος διαχωρισμού κατά την οποία φορτισμένα μόρια (πχ. πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα), μετακινούνται υπό την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος στο εσωτερικό πηκτών ή διαλυμάτων. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Ηλεκτροφόρηση DNA

Συσκευές ηλεκτροφόρησης Κάθετη Οριζόντια

Η ηλεκτροφορητική ικανότητα των φορτισμένων μορίων εξαρτάται από: 1. Το καθαρό φορτίο των μορίων: Τα αρνητικά φορτισμένα μόρια κινούνται προς την άνοδο (+), ενώ θετικά φορτισμένα μόρια προς την κάθοδο (-).

Η ηλεκτροφορητική ικανότητα των φορτισμένων μορίων εξαρτάται από: 2. Το μέγεθος των μορίων: 3. Το σχήμα των μορίων: Η κινητικότητα είναι διαφορετική ανάμεσα στις σφαιρικές και τις ινώδεις πρωτεΐνες ή ανάμεσα στο γραμμικό και στο κυκλικό DNA 4. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου. Όσο αυξάνεται τόσο αυξάνεται και η κινητικότητα.

Ηλεκτροφόρηση DNA Το δείγμα DNA μπορεί να προέρχεται από: Απομόνωση από ιστό ή κύτταρα Απομόνωση από βιολογικά υγρά πχ. Πλάσμα, ούρα, ΕΝΥ Προϊόν αντίδρασης PCR Πλασμιδιακό DNA Επειδή το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης και εφαρμόζοντας ηλεκτρικό πεδίο θα μετακινηθεί προς τον θετικό πόλο. Άρα θα διαχωριστεί με βάση το μέγεθος. Με την ηλεκτροφόρηση ενός δείγματος DNA σε πήκτωμα αγαρόζης έχουμε τη δυνατότητα να εκτιμήσουμε το μέγεθος, την ποιότητα αλλά και την ποσότητα του εξεταζόμενου DNA.

Προσδιορισμός μεγέθους τμήματος DNA Το μέγεθος του υπό μελέτη τμήματος DNA προσδιορίζεται με τη βοήθεια δεικτών μοριακών βαρών (DNA ladder), δηλαδή τμήματα DNA γνωστού μοριακού μεγέθους.

Πηκτή αγαρόζης Η αγαρόζη είναι ένας πολυσακχαρίτης που προέρχεται από φύκη (red algae) και χρησιμοποιείται συχνά στη ζαχαροπλαστική, σε καλλιεργητικά μέσα και για την παρασκευή πηκτωμάτων ηλεκτροφόρησης. Πολυμερίζεται στους 100°C δημιουργώντας ένα κολλώδες διάλυμα το οποίο πήζει σε θερμοκρασία μικρότερη από 45°C σχηματίζοντας πόρους στο εσωτερικό του. Ανάλογα με τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα σχηματίζονται πόροι που επιτρέπουν το διαχωρισμό μορίων μεγέθους από 50 ζεύγη βάσεων (bp) μέχρι 60κιλοβάσεις (kb)

Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης DNA Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης χωρίζεται σε τρία στάδια : Παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης, κατάλληλης συγκέντρωσης για το μέγεθος των μορίων του DNA που επιθυμούμε να διαχωρίσουμε σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE. Το ρυθμιστικό διάλυμα παρέχει τα απαραίτητα ιόντα για να πραγματοποιείται μεταφορά ρεύματος και διατηρεί σταθερό το pH 2. Τοποθέτηση των δειγμάτων στις θέσεις υποδοχής τους στο πήκτωμα, προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος στη συσκευή και εφαρμογή της κατάλληλης ηλεκτρικής τάσης στη δεξαμενή ηλεκτροφόρησης για τη βέλτιστη χρονική περίοδο για τον διαχωρισμό των μορίων DNA.

Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης DNA

Πώς φτιάχνω μια πηκτή αγαρόζης;

Ηλεκτροφόρηση DNA

Προετοιμασία του δείγματος Τα δείγματα που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν προετοιμάζονται κατάλληλα με την ανάμιξή τους με διάλυμα «φόρτωσης» 10Χ. Οι θέσεις υποδοχής των δειγμάτων στο πήκτωμα χωράνε συνήθως περί τα 30 μl δείγματος, έτσι η ποσότητα του δείγματος που θα προετοιμαστεί δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τη χωρητικότητα των θέσεων υποδοχής. Διάλυμα φόρτωσης: Τα διαλύματα φόρτωσης περιέχουν μία ουσία υψηλής πυκνότητας (συνήθως γλυκερόλη) και μία ή δύο χρωστικές που μετακινούνται στο πήκτωμα με ταχύτητα περίπου ίδια με μικρά μόρια DNA (συνήθως μπλε της βρωμοφαινόλης και κυανούν του ξυλενίου). Η παρουσία της γλυκερόλης διασφαλίζει ότι τα δείγματα έχουν πυκνότητα μεγαλύτερη του υδατικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης και μπορούν να καθιζάνουν στις θέσεις υποδοχής. Επιπλέον, οι δύο χρωστικές χρωματίζουν τα δείγματα, γεγονός που διευκολύνει τη διαδικασία του φορτώματος στο πήκτωμα αγαρόζης. Κατά τη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης οι μπλε ορατές ζώνες μάς προσφέρουν μια αδρή εκτίμηση του ρυθμού μετακίνησης των μορίων DNA στο πήκτωμα.

Πληροφορίες που παίρνουμε από την ηλεκτροφόρηση δειγμάτων DNA

Εύρεση μεγέθους τμήματος DNA μετά από ηλεκτροφόρηση Μάρτυρες Αποδομημένο DNA Ανίχνευση τμήματος DNA μεγέθους 300bp Απουσία DNA

Παράγοντες που επηρεάζουν την ηλεκτροφορητική κινητικότητα Το μέγεθος του DNA. Όσο μικρότερα είναι τα μόρια του DNA τόσο πιο εύκολα κινούνται μέσα στους πόρους του πηκτώματος και τόσο πιο μακριά μεταναστεύουν κατά μήκος του. Αντίθετα, τα μεγαλύτερα μόρια DNA συναντούν μεγαλύτερη αντίσταση στους πόρους του πηκτώματος και έτσι κινούνται βραδύτερα και παραμένουν προς το επάνω μέρος του πηκτώματος Τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της αγαρόζης τόσο μικρότεροι είναι οι πόροι που σχηματίζονται στο πήκτωμα και τόσο μεγαλύτερη είναι η αντίσταση που συναντούν τα μόρια DNA κατά την κίνησή τους. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου. Γενικά όσο αυξάνει η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου που εφαρμόζεται στο πήκτωμα τόσο πιο γρήγορα κινούνται τα μόρια του DNA.

Παράδειγμα εφαρμογής ηλεκτροφόρησης Ταυτοποίηση δράστη

Ερωτήσεις: Τι θα συμβεί αν αντί για διάλυμα ηλεκτροφόρησης (0,5X TBE) τοποθετήσετε απεσταγμένο νερό στο λουτρό της ηλεκτροφόρησης; Έχετε παρασκευάσει ένα πήκτωμα αγαρόζης και έχετε ηλεκτροφορήσει τα προϊόντα μιας αντίδρασης PCR. Κατά τη λήψη της φωτογραφίας του πηκτώματος παρατηρείτε ότι δεν υπάρχει καμία ορατή ζώνη στο πήκτωμα. Τι μπορεί να έχει συμβεί σε κάθε περίπτωση; Διαθέτετε πηκτές αγαρόζης πυκνότητας 0,5% και 2%. Ποιο από τα δύο θα χρησιμοποιούσατε για διαχωρισμό τμημάτων DNA μεγέθους 100bp, 50bp, 200bp, και 10.000bp, 8.000bp, 5.000bp.

Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμίδης Μίγμα ακρυλαμιδίου και δις-ακρυλαμιδίου που πολυμεριζόμενο σχηματίζει ένα δίκτυο με πόρους ορισμένης διαμέτρου.

Προετοιμασία δείγματος πρωτεϊνών 1. Απομόνωση πρωτεϊνών από κύτταρα ή ιστούς μέσω διαλύματος λύσης, επώαση για 30 λεπτά και επακόλουθη φυγοκέντρηση. χρωστική 2. 3. Βρασμός

Η μετακίνηση των πρωτεϊνών εξαρτάται από το μέγεθος των πόρων στην πηκτή ακρυλαμίδης. Για πρωτεΐνες μικρού μοριακού βάρους κατασκευάζονται πυκνές πηκτές ενώ για πρωτεΐνες μεγάλου μοριακού βάρους χρησιμοποιούνται πηκτές με μικρή συγκέντρωση ακρυλαμίδης.

SDS-PAGE Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή ακρυλαμίδης πραγματοποιείται σε αποδιατακτικές συνθήκες όπου προστίθεται στις δύο πηκτές (stacking and separating gel) ο αποδιατακτικός παράγοντας SDS. Επιπλέον, το SDS είναι ένα αρνητικά φορτισμένο απορρυπαντικό που φορτίζει αρνητικά όλες τις πρωτεΐνες ώστε να διαχωρίζονται μόνο με βάση το μοριακό τους μέγεθος κινούμενες προς την άνοδο.

Δύο πηκτές διαχωρισμού Stacking gel (5%): απαιτείται ώστε όλες οι πρωτεΐνες του δείγματος να πακετάρονται σε μια ζώνη και να ξεκινούν την ίδια στιγμή και από το ίδιο σημείο για το διαχωρισμό τους Separating gel (12%): διαχωρισμός των πρωτεϊνών ανάλογα με το μοριακό τους βάρος.

Κατασκευή πηκτής ακρυλαμίδης

Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή ακρυλαμίδης

Απεικόνιση πρωτεϊνών Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης οι πρωτεΐνες μπορεί να γίνουν ορατές μετά από χρώση της πηκτής με τη χρωστική Coomasie blue με άργυρο.

Απεικόνιση πρωτεϊνών Ή με αντίσωμα (ανοσοαποτύπωση ή Western blot)

Aνοσοαποτύπωση ή Western blot

Aνοσοαποτύπωση ή Western blot Εμφάνιση

Ανοσοαποτύπωση (Western blotting)

Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών αίματος

Παθολογικές καταστάσεις Παραπρωτεινουρία Αιματουρία

Ερωτήσεις Τι εξυπηρετούν τα δύο πηκτώματα σε μια πηκτή πολυακρυλαμίδης για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών; Ποιες διαφορές υπάρχουν ως προς τη σύστασή τους; Ποιος ο ρόλος του SDS και του DTT για την ηλεκτροφόρηση ενός πρωτεϊνικού δείγματος; Θέλετε να ελέγξετε εάν υπάρχει σε ένα πρωτεϊνικό δείγμα η πρωτεΐνη Α με μοριακό βάρος 70.000Da. Τι πυκνότητας πηκτή θα χρησιμοποιούσατε 3%, 8% ή 15%; Γιατί; Με ποιον τρόπο θα επιλέγατε να κάνετε την ανίχνευσή της: χρώση με Coomasie blue, χρώση με άργυρο ή με αντίσωμα; Γιατί;