ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ

Κατηγορίες Μοριακών Δεικτών DNA ΔΕΙΚΤΕΣ 1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), 2. Randomly Amplified DNA Polymorphism (RAPD), 3. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), and 4. Simple Sequence Repeats (SSRs), or Microsatellites 5. Minisatellites ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ Ισοένζυμα Αλλοένζυμα

EXPRESSION OF PEROXIDASE AND GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE ISOZYMES IN VIOLA CORNUTA L. DURING SEED GERMINATION W.C. MITCHELL1 AND S. H. BARRETT Expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase isozymes during seed germination and seedling growth. Each lane has the amount of protein equivalent to that extracted from four seeds or seedlings. Lane 1, protein from seeds imbibed for one day; Lane 2, protein from seeds and seedlings imbibed for three days; Lane 3, protein from seeds and seedlings imbibed for seven days.

ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ Βασιζόμενοι σε PCR

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Απομόνωση DNA Αναπαραγωγή τμημάτων DNA με PCR, χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές Διαχωρισμός των τμημάτων DNA με ηλεκτροφόρηση αγαρόζης (τμήματα μεγέθους 0.5-5 kb) Ανίχνευση πολυμορφισμού με χρώση βρωμιούχου εθιδίου και χρησιμοποιώντας υπεριώδη ακτινοβολία ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Θερμοκυκλοποιητής Εξοπλισμός για ηλεκτροφόρηση αγαρόζης Πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας

RAPD

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Η RAPD είναι ένας τύπος PCR αντίδρασης όπου τα τμήματα DNA που ενισχύονται είναι τυχαία. Δημιουργούνται τυχαίοι ως προς την αλληλουχία τους, μικρού μήκους εκκινητές με 8-12 bp, εκτελούμε μία PCR αντίδραση με τη χρήση γενομικού DNA προσδοκώντας ότι κάποια από τα τεμάχια DNA θα ενισχυθούν. Τα προϊόντα PCR διαχωρίζονται με ηλεκτρoφόρηση και έπειτα υπό ακτινοβολία UV και με τη βοήθεια βρομιούχου αιθιδίου παρατηρούμε αν τυχόν ενισχύθηκε κάποιο τεμάχιο DNA.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Απαιτείται χαμηλή συγκέντρωση DNA (5-50 ng για κάθε αντίδραση) Δεν απαιτείται γνώση της αλληλουχίας για την κατασκευή εκκινητών Η δοκιμή γίνεται εύκολα και γρήγορα Χαμηλό κόστος Άφθονοι Τυχαία διασκορπισμένοι στο γονιδίωμα Πολλές ζώνες σε κάθε αντίδραση Δυνατότητα αυτοματισμού ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Απαιτείται καθαρό, μεγάλου μοριακού βάρους DNA Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή μολύνσεων Απαιτείται ιδιαίτερη κανονικοποίση των συνθηκών της αντίδρασης Οι ζώνες που αναπαράγονται δεν μπορούν να αποδοθούν σε γενετικούς τόπους και αλληλομόρφους Κυρίαρχοι αλληλόμορφοι Μικρή επαναληψιμότητα Τμήματα ίδιου μεγέθους μπορεί να μην είναι ομόλογα

ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ Βασιζόμενοι σε πέψη

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Είναι μια τεχνική με την οποία οι οργανισμοί μπορούν να κατηγοριοποιηθούν με βάση την ανάλυση των προτύπων που προκύπτουν από την πέψη του DNA τους, με περιοριστικές ενδονουκλεάσες . Σταδία: Αρχικά λαμβάνουμε το δείγμα DNA και το καθαρίζουμε. Έπειτα κόβεται με τις κατάλληλες ενδονουκλεάσες. Τα τεμάχια περιορισμού διαχωρίζονται σύμφωνα με το μήκος τους, με ηλεκτροφόρηση. Τα τμήματα DNA αποτυπώνονται σε μεμβράνη πριν υβριδοποιηθούν με κατάλληλο ιχνηλάτη (ραδιοσιμασμένο ή όχι) με τη μέθοδο Southern.

Phylogenetic study of A-genome species of genus Oryza using nuclear RFLP Kazuyuki DOI1, Atsushi YOSHIMURA1, Mutsuko NAKANO1, Nobuo IWATA1 and Duncan A. VAUGHAN2

ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ Μικτές τεχνικές

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό πολυμορφισμών στο DNA. Περιλαμβάνει τρία στάδια : Πέψη του ολικού κυτταρικού DNA με ένα ή περισσότερα ένζυμα περιορισμού και σύνθεση των κομματιών που προκύπτουν με ειδικούς δίκλωνους προσαρμογείς. Επιλεκτική ενίσχυση κάποιων από αυτά τα κομμάτια με δυο τυχαίους εκκινητές που έχουν αλληλουχίες ειδικές με τη θέση αναγνώρισης και τον προσαρμογέα αντίστοιχα. Οι εκκινητές προσδιορίζονται και εντοπίζονται με ραδιενέργεια, τα προϊόντα της ενίσχυσης διαχωρίζονται και διακρίνονται με ηλεκτρoφόρηση και τα ενζυμικά συστήματα απεικονίζονται μέσω της αυτοραδιογραφίας.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Διαδικασία Απομόνωση DNA Πέψη του DNA με περιοριστικά ένζυμα και πρόσδεση ολιγονουκλεοτιδίων προσαρμοστών στα τμήματα του DNA Επιλεκτική αναπαραγωγή τμημάτων DNA Διαχωρισμός τμημάτων με ηλεκτροφόρηση πολυακριμαλίδης Ανίχνευση με αυτοραδιογραφία, χρώση με άργυρο, ή φθωρισμό Απαιτούμενος εξοπλισμός Θερμοκυκλοποιητής Εξοπλισμός για ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμίδης (Δυνατότητα χρήσης ραδιενέργειας)

AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Για την κατασκευή εκκινητών δεν χρειάζεται να είναι γνωστή η αλληλουχία Βρίσκονται άφθονοι στο γονιδίωμα Γενικώς είναι διασκορπισμένοι στο γονιδίωμα, αν και σε μερικές περιπτώσεις εντοπίζονται γύρω από τα κεντροσωμάτια Αναπαραγωγή πολλών «ζωνών» σε κάθε αντίδραση Επαναληψιμότητα Πολλές εφαρμογές Δυνατότητα αυτοματισμού ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Απαιτείται απομόνωση πολύ καθαρού DNA, μεγάλου μοριακού βάρους Το DNA προφίλ δεν μπορεί να ερμηνευθεί σχετίζοντας αλληλόμορφους και γενετικούς τόπους Κυρίαρχοι αλληλόμορφοι Παρόμοιου μεγέθους τμήματα, μπορεί να μην είναι ομόλογα

Μικροδορυφόροι

ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) Περιέχουν εν σειρά επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες. Η βασική επαναλαμβανόμενη μονάδα αποτελείται από 2 ή 3 ζεύγη βάσεων που έχουν δίπλα 4-10 επαναλαμβανόμενες μονάδες (repeat units). Αυτοί οι πολυμορφισμοί ονομάζονται μικροδορυφόροι (microsatellites). Οι ISSR εκκινητές περιλαμβάνουν λίγες επαναλήψεις μικροδορυφόρων και αυθαίρετα επιλεγμένα ζεύγη βάσεων στο 3’ άκρο. Όπου ο εκκινητής κολλάει σε δυο μικροδορυφορικές αλληλουχίες επιτυχώς, το μεταξύ τους τμήμα ενισχύεται και δίνει μια μπάντα έπειτα από ηλεκτροφόρηση.

Μικροδορυφόροι SSRs(simple sequence repeats ), STRs (short tandem repeats) ή SSLPs (simple sequence length polymorphisms), είναι τυχαία επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες συνήθως μικρότερες από 5 bp π.χ., (TG)n ή (AAT)n. Χρησιμοποιώντας τον κατάλληλο εκκινητή μπορούμε να της πολλαπ/σουμε με PCR.

Use of ISSR molecular marker approach to estimate genetic diversity in rice and barley allelopathy DNA fragment of barley amplified by ISSR 11 primer W.X. Lin1,2, H.Q. He1,2, X.X. Chen1, J. Xiong1, B.Q. Song2, Y.Y. Liang2 and K.J. Liang2

ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Μικροδορυφόροι ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Απομόνωση DNA Αναπαραγωγή τμημάτων τυχαία επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών με PCR Διαχωρισμός «ζωνών» με ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαμίδης ή αγαρόζης Ανίχνευση του πολυμορφισμού με αυτοραδιογραφία, χρώση με άργυρο, ή φθωρισμό, (πολυακρυλαμίδη) ή χρώση με βρωμιούχο εθίδιο και χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας (αγαρόζη) ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Θερμοκυκλοποιητής Εξοπλισμός για ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμίδης (Δυνατότητα χρήσης ραδιενέργειας) (Πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας)

The extent of polymorphism determines the use of the marker Savelkoul et al, JCM 1999, 3083-3091 UPV – Valencia SPAIN May 2006 Dr. ELIAS ANASTASSOPOULOS

Dr. ELIAS ANASTASSOPOULOS UPV – Valencia SPAIN May 2006 Dr. ELIAS ANASTASSOPOULOS

Μικροδορυφόροι ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Απαιτείται χαμηλή συγκέντρωση DNA required (10-100 ng/ αντίδραση) Βρίσκονται σε αφθονία στο γονιδίωμα Γενικώς είναι διασκορπισμένοι στο γονιδίωμα Οι «ζώνες» μπορούν να αποδοθούν σε γενετικούς τόπους/αλληλομόρφους Συγκυρίαρχοι αλληλόμορφοι Οι αλληλόμορφοι μπορεί να υπολογισθούν με ακρίβεια 1 bp επιτρέποντας συγκρίσεις σε διαφορετικά πηκτώματα Επαναληψιμότητα Πολλές εφαρμογές Δυνατότητα αυτοματισμού ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Υψηλό κόστος αν δεν υπάρχουν γνωστοί εκκινητές Ετερόζυγα άτομα μπορεί να θεωρηθούν ομόζυγα, όταν εμφανίζονται «μηδενικά» αλληλόμορφα, εξαιτίας μετάλλαξης σε θέση πρόσδεσης εκκινητή «Λάθος» ζώνες δυσχεραίνουν την βαθμολόγιση του πολυμορφιμού Παρόμοιου μεγέθους τμήματα, μπορεί να μην είναι ομόλογα Το μοντέλο της δημιουργία τέτοιων μεταλλάξεων παραμένει άγνωστο Ενδέχεται να υποτιμηθεί η γενετική απόκλιση (genetic divergence) μεταξύ ατόμων

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΣΤΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ Α) Επιλογή με την βοήθεια μοριακών δεικτών (Marker-assisted selection). Χρησιμοποιώντας μοριακούς δείκτες που είναι στενά συνδεδεμένοι, ή βρίσκονται μέσα σε έναν ή περισσότερους γενετικούς τόπους ποσοτικών χαρακτήρων (QTL) η επιλογή γίνεται περισσότερο αποτελεσματική Β) Ενσωμάτωση γονιδίων από άγρια είδη με την βοήθεια δεικτών (Marker assisted introgression). Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για π.χ. όταν θέλουμε να ενσωματώσουμε γονίδια από ένα άγριο φυτό σε μία καλλιεργούμενη ποικιλία Γ) Μελέτες γενετικής ποικιλομορφίας και ταξονομικών/φυλλογενετικών σχέσων ανάμεσα σε διαφορετικά φυτικά είδη ή ανάμεσα σε πληθυσμούς (ή ποικιλίες) συγκεκριμένων ειδών. Δ) Μελέτες βιολογικών διεργασιών, όπως ο τρόπος αναπαραγωγής, ο διασκορπισμός της γύρης, ή των σπόρων, και γενετικών μηχανισμών που καθορίζουν χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την φυσιολογία των φυτών.