Αναστασία Μυρίσσα, Ιωάννα Πέττα και Κωνσταντίνος Φλυτζάνης Εξάπλωση των ισομορφών του μεταγραφικού παράγοντα COUP-TF στα Δευτεροστόμια Αναστασία Μυρίσσα, Ιωάννα Πέττα και Κωνσταντίνος Φλυτζάνης Τομέας Γενετικής Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Εισαγωγή Το γονίδιο COUP-TF: Κωδικοποιεί έναν ορφανό πυρηνικό υποδοχέα. Αποτελεί μέλος της υπεροικογένειας των στεροειδών / θυρεοειδών / ρετινοειδών υποδοχέων. Είναι εξαιρετικά συντηρημένο μόριο σε όλα τα Μετάζωα. Στον αχινό το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξόνια. Παρατηρείται εναλλακτικό μάτισμα των μεταγράφων του γονιδίου COUP-TF και συνεπώς παράγονται δύο διαφορετικές πρωτεΐνες. Οι δύο αυτές πρωτεΐνες διαφέρουν ως προς την ενδοκυτταρική τοποθεσία τους και ως προς την ικανότητα πρόσδεσής τους στο DNA. Το εναλλακτικό μάτισμα δεν συμβαίνει στα Πρωτοστόμια και στα Σπονδυλωτά. Σκοπός της εργασίας: Εναλλακτικό μάτισμα των μεταγράφων COUP-TF σε Εχινόδερμα και άλλα Δευτεροστόμια.

Υλικά - Μέθοδοι Συλλογή οργανισμών (Εχινόδερμα, Ουροχορδωτά) Απομόνωση ιστών (γονάδων ή εμβρύων) Απομόνωση ολικού RNA RT-PCR (σε RNA) ή PCR (σε cDNA) Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακό φορέα Επιλογή κλώνων Αλληλούχιση

PCR Oxycomanthus japonicus RT-PCR Lytechinus variegatus Αποτελέσματα b PCR Oxycomanthus japonicus L Oj a RT-PCR Lytechinus variegatus Lv Το εναλλακτικό μάτισμα έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δύο μεταγράφων που αντιπροσωπεύονται ως δύο προϊόντα cDNA μετά από RT-PCR, στο πήκτωμα αγαρόζης. Το κόκκινο βέλος υποδηλώνει το μεγάλο προϊόν μεγέθους 346bp και το μπλε το μικρό προϊόν μεγέθους 286bp.

Νουκλεοτιδικές και αμινοξικές αλληλουχίες της μεγάλης ισομορφής του γονιδίου COUP-TF

Συμπεράσματα Προηγούμενα πειράματα στο εργαστήριό μας έδειξαν ότι το εναλλακτικό μάτισμα των μεταγράφων του γονιδίου COUP-TF δεν παρατηρείται στα Σπονδυλωτά όπως στο ποντίκι και στο zebrafish. Με το πρόγραμμα BLAST ψάξαμε στις βάσεις δεδομένων για αλληλουχία ομόλογη με αυτήν του δεύτερου εξονίου του γονιδίου COUP-TF του αχινού Paracentrotus lividus. Η αναζήτηση αυτή δεν έδειξε ομόλογη αλληλουχία στα ήδη αλληλουχιμένα γονιδιώματα και ESTs με εξαίρεση αυτήν του αχινού Strongylocentrotus purpuratus. Τα πειράματά μας έδειξαν ότι το εναλλακτικό μάτισμα παραμένει συντηρημένο στα Εχινόδερμα και επεκτείνεται στα Ουροχορδωτά χωρίς να παρουσιάζεται σε άλλες ομάδες των Δευτεροστομίων όπως στα Κεφαλοχορδωτά και στα Σπονδυλωτά. Αυτό υποδεικνύει ότι το εναλλακτικό μάτισμα των μεταγράφων COUP-TF προηγείται της φυλογένεσης των Δευτεροστομίων. Στις αλληλουχίες του γονιδίου COUP-TF των διαφόρων οργανισμών που μελετήθηκαν παρατηρήθηκαν ελάχιστες αμινοξικές αλλαγές κυρίως στην περιοχή του δεύτερου εξονίου και σε συγκεκριμένες θέσεις. Οι δύο ισομορφές COUP-TF διαφέρουν ως προς την ενδοκυτταρική τοποθεσία τους καθώς επίσης και ως προς την ικανότητα πρόσδεσης στο DNA. Η μικρή πρωτεΐνη εισέρχεται στον πυρήνα και έχει τη δυνατότητα πρόσδεσης στο DNA. Αντίθετα, η μεγάλη πρωτεΐνη δεν προσδένεται στο DNA και βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα. Παραμένει να δειχθεί αν αυτό αποτελεί ένα φαινόμενο που ισχύει στα Εχινόδερμα και στα Ουροχορδωτά και αν αποτελεί ένα ρυθμιστικό μηχανισμό σε αυτούς τους οργανισμούς ο οποίος αντικαταστάθηκε στα άλλα Δευτεροστόμια.