Βασιλική Γκιώνη Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων Εργαστήριο Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού & Γήρανσης Ινστιτούτο Βιολογίας, ΕΚΕΦΕ ¨Δημόκριτος¨ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΣΤΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΓΗΡΑΝΣΗ Βασιλική Γκιώνη Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΉ»

Ο ρόλος του TGF-β στον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων πνευμονικών ινοβλαστών εμβρύου και ενηλίκου

Η ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΖΟΝΤΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ Β (TRANSFORMING GROWTH FACTOR Β - TGF-Β) Ann Rev Biochem 67: 753, 1998

Transforming Growth Factor-β, TGF-β Ο ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΖΩΝ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ β Transforming Growth Factor-β, TGF-β Είναι ένα ομοδιμερές μοριακού βάρους 25kDa Συντίθεται και εκκρίνεται από τα κύτταρα σε μορφή ανενεργού συμπλόκου Διαθέτει δύο υποδοχείς με δράση κινάσης σερίνης-θρεονίνης: Τύπου Ι και Τύπου ΙΙ (γλυκοπρωτεΐνες μοριακού βάρους 55 και 75kDa) και τον υποδοχέα Τύπου ΙΙΙ (μία πρωτεογλυκάνη μοριακού βάρους 280kDa, τη βηταγλυκάνη) Werner S. et al (2003)

Ο μηχανισμός ενεργοποίησης των υποδοχέων του TGF-β Ann Rev Biochem 67: 753, 1998

Transcription of target genes Τα ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από τον αυξητικό παράγοντα TGF-β p70S6K EMT ? ? PKCα PKA ? Transcription of target genes

Βιολογικός ρόλος του Transforming Growth Factor-β Συμμετέχει στη ρύθμιση: του κυτταρικού πολλαπλασιασμού της απόπτωσης της κυτταρικής μετανάστευσης της διαφοροποίησης της ανοσολογικής απόκρισης της συσσώρευσης της εξωκυττάριας μήτρας παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη αλλά και στη ρύθμιση της ομοιοστασίας των ιστών στον ενήλικο οργανισμό

Ο ρόλος του TGF-β στην επούλωση της πληγής Παρεμβαίνει σε σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως ο χημειοτακτισμός, η διαφοροποίηση και η απόπτωση Eπάγει την έκφραση των περισσότερων πρωτεϊνών της ECM Αναστέλλει την έκφραση διάφορων μεταλλοπρωτεασών (MMP) Επάγει την έκφραση των αναστολέων των μεταλλοπρωτεασών (TIMP) Συμβάλλει στην αγγειογένεση Werner S. et al (2003)

Σύγκριση της επούλωσης στο έμβρυο και στον ενήλικο Παράμετροι της επουλωτικής διαδικασίας Έμβρυο Ενήλικος Ουλή όχι ναι Κυτταρικός πολλαπλασιασμός ταχύς βραδύς Υγρό περιβάλλον Άσηπτες συνθήκες Φλεγμονή όχι έντονη έντονη Αγγειογένεση περιορισμένη εκτεταμένη Επιθηλιοποίηση ταχεία βραδεία Εναπόθεση συστατικών εξωκυττάριας μήτρας Κολλαγόνο κυρίως τύπου ΙΙΙ κυρίως τύπου Ι TGF-β κυρίως TGF-β3 κυρίως TGF-β1 Προσαρμογή από Adzich and Lorenz (1994)

Η επίδραση του TGF-β στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό O TGF-β αποτελεί παράδειγμα πλειοτροπικού παράγοντα. Η δράση του εξαρτάται από το είδος του κυττάρου-στόχου. Αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Επάγει τον πολλαπλασιασμό μεσεγχυματικών κυττάρων.

Giannouli and Kletsas (2006) Ο ρόλος του TGF-β στον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών εμβρύου και ενηλίκου Ινοβλάστες εμβρύου : Ινοβλάστες ενηλίκου : ενεργοποίηση PKA έκλυση FGF-2 Μεταγραφή και μετάφραση των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου p21CIP1/WAF1 και p15INK4B ενεργοποίηση Ras-Raf-MEK-ERK αναστολή του κυτταρικου πολλαπλασιασμού επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Giannouli and Kletsas (2006)

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η μελέτη της ρύθμισης του πολλαπλασιασμού ανθρώπινων πνευμονικών ινοβλαστών εμβρύου και ενηλίκου από τον TGF-β

Κυτταρικές σειρές Αναπτύχθηκαν, με τη χρήση της κλασσικής μεθοδολογίας των κυτταροκαλλιεργειών, πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών ενηλίκου από την περιοχή του πνεύμονα (Diploid Lung Fibroblasts, DLF). Χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εμπορικά διαθέσιμες εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές: DLF MRC-5: Ανθρώπινοι πνευμονικοί ινοβλάστες από έμβρυο 14 εβδομάδων. IMR-90: Ανθρώπινοι πνευμονικοί ινοβλάστες από έμβρυο 16 εβδομάδων. WI-38: Ανθρώπινοι πνευμονικοί ινοβλάστες από έμβρυο 3 μηνών. HFL-1: Ανθρώπινοι πνευμονικοί ινοβλάστες από έμβρυο αγνώστου σταδίου κύησης MRC-5

Διαφορική ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των ανθρώπινων πνευμονικών ινοβλαστών εμβρύου και ενηλίκου από τον TGF-β

Η πολλαπλασιαστική δράση του TGF-β στους εμβρυϊκούς ινοβλάστες

Η δράση του TGF-β στους ανθρώπινους πνευμονικούς εμβρυϊκούς ινοβλάστες είναι διεγερτική και δοσοεξαρτώμενη

Έλεγχος ύπαρξης αυτοκρινούς μηχανισμού Χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω αναστολείς: Σουραμίνη, χημικός παρεμποδιστής της πρόσδεσης αυξητικών παραγόντων στους αντίστοιχους υποδοχείς τους STI571, αναστολέας των υποδοχέων του PDGF SU5402, αναστολέας του υποδοχέα του FGF-2

Ο TGF-β επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό πνευμονικών εμβρυϊκών ινοβλαστών μέσω αυτοκρινούς μηχανισμού

Η παρουσία του ειδικού αναστολέα των υποδοχέων του PDGF STI 571 δεν επηρεάζει την επαγωγή του πολλαπλασιασμού από τον TGF-β στους εμβρυϊκούς ινοβλάστες

Η παρουσία του ειδικού αναστολέα των υποδοχέων του FGF-2 SU 5402 παρεμποδίζει σημαντικά τη μιτογόνο δράση του TGF-β

Η επίδραση εξουδετερωτικού αντισώματος έναντι του αυξητικού παράγοντα FGF-2 παρεμποδίζει εν μέρει τη μιτογόνο δράση του TGF-β στους ανθρώπινους πνευμονικούς εμβρυϊκούς ινοβλάστες

Ο TGF-β προκαλεί την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών MEK1/2/ERK-1/2 και PI-3K/Akt στους ανθρώπινους εμβρυϊκούς πνευμονικούς ινοβλάστες. 0 0.3 1 3 6 12 18 24 TGF-β (h) pERK pAkt ERK2 Akt MRC-5

Ο TGF-β προκαλεί την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών MEK1/2/ERK-1/2 και PI-3K/Akt στους ανθρώπινους εμβρυϊκούς πνευμονικούς ινοβλάστες. 0 0.3 1 3 6 12 18 24 TGF-β (h) pERK pAkt ERK2 Akt WI-38

- - - - - - + + - - - - + + - - - - + + - - - - - + - + - + - + Ο TGF-β προκαλεί την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών MEK1/2/ERK-1/2 και PI-3K/Akt στους ανθρώπινους εμβρυϊκούς πνευμονικούς ινοβλάστες μέσω αυτοκρινούς δράσης του FGF-2 MRC-5 - + - + - + - + TGF-β pERK pAkt ERK2 Akt SU 5402 STI 571 Suramin - - + + - - - - - - - - + + - - - - - - - - + +

Η γουορτμαννίνη επηρεάζει εν μέρει την πολλαπλασιαστική δράση του TGF-β στους εμβρυϊκούς ινοβλάστες

Ο ειδικός αναστολέας της φωσφορυλίωσης των ERK-1/2, παρεμποδίζει εν μέρει τη μιτογόνο δράση του TGF-β

ο TGF-β επάγει τον πολλαπλασιασμό των εμβρυϊκών ινοβλαστών δευτερογενώς (αυτοκρινώς), εν μέρει μέσω της δράσης του FGF-2 η ενεργοποίηση των μονοπατιών MEK1/2 / ERK-1/2 και PI-3K/Akt από τον TGF-β μεσολαβείται εν μέρει από τον FGF-2 μέσω αυτοκρινούς μηχανισμού η PI-3K και οι ERK-1/2 συμμετέχουν εν μέρει στη μετάδοση σήματος από τον TGF-β για τον πολλαπλασιασμό εμβρυϊκών πνευμονικών ινοβλαστών

Η ανασταλτική δράση του TGF-β σε πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου

Η ανασταλτική δράση αυξανόμενων συγκεντρώσεων TGF-β στους πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου

Ο TGF-β προκαλεί την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών MEK1/2/ERK-1/2 και PI-3K/Akt και στους ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου 0 0.5 1 3 6 12 18 24 TGF-β (h) pERK pAkt ERK2 Akt Ινοβλάστες Ενηλίκου

Ο TGF-β προκαλεί αύξηση του αναστολέα των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών p21WAF1 στους πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου. TGF-β (h) p21WAF1 Actin Ινοβλάστες Ενηλίκου 0 6 12 18 24

Ο TGF-β δεν προκαλεί μεταβολή των επιπέδων της p21WAF1 στους εμβρυϊκούς ινοβλάστες TGF-β (h) p21WAF1 Actin Εμβρυϊκοί Ινοβλάστες 0 6 12 18 24

Η ινδομεθακίνη δεν επηρεάζει την ανασταλτική δράση του TGF-β στον πολλαπλασιασμό πνευμονικών ινοβλαστών ενηλίκου

Η ενεργοποίηση της PKA είναι απαραίτητη για την αναστολή του πολλαπλασιασμού από τον TGF-β στους ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου

Ο TGF-β προκαλεί αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης p21WAF1 μέσω ενεργοποίησης της PKA στους πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου - + - + TGF-β p21WAF1 Actin Ινοβλάστες Ενηλίκου H-89 (4μM) - - + +

ο TGF-β επάγει την έκφραση της p21WAF1 στους ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου μέσω της ενεργοποίησης της PKA και οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα c-ski στη διαφορική δράση του TGF-β σε πνευμονικούς ινοβλάστες εμβρύου και ενηλίκου

Μείωση των επιπέδων έκφρασης του c-ski παρουσία του TGF-β στους ινοβλάστες ενηλίκου και εμβρύου 0 45 120 Time (min) c-ski Actin Εμβρύου Ενηλίκου TGF-β - + + - + + Ινοβλάστες 0 25 2500 0 25 2500 TGF-β (pg/ml) c-ski Actin Εμβρύου Ενηλίκου Ινοβλάστες

Ο TGF-β προκαλεί μείωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης c-ski μέσω πρωτεοσώματος στους ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες εμβρύου και ενηλίκου Ινοβλάστες Εμβρύου Ενηλίκου c-ski Actin MG-132 TGF-β - + - + - + - + - - + + - - + +

η αναστολή του πολλαπλασιασμού στους πνευμονικούς ινοβλάστες ενηλίκου και η διέγερση στους πνευμονικούς εμβρυϊκούς ινοβλάστες, από τον TGF-β, συνοδεύονται από μείωση των επιπέδων έκφρασης του c-ski μέσω της ενεργοποίησης του πρωτεοσώματος

Συμπεράσματα Ο TGF-β ρυθμίζει διαφορικά τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων πνευμονικών ινοβλαστών εμβρύου και ενηλίκου Στους ινοβλάστες εμβρύου ο TGF-β επάγει τον πολλαπλασιασμό, δευτερογενώς, εν μέρει μέσω της δράσης του FGF-2 Στους ινοβλάστες ενηλίκου ο TGF-β προκαλεί ενεργοποίηση της PKA, η οποία επιτρέπει την επαγωγή του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21WAF1, η οποία οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου. ο TGF-β αναστέλλει την έκφραση του c-ski τόσο σε κύτταρα εμβρύου όσο και ενηλίκου. Η μείωση αυτή είναι αποτέλεσμα της δράσης του πρωτεοσώματος

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Στον κ. Λ.Χ. Μαργαρίτη, Καθηγητή Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας Παν/μίου Αθηνών Στον κ. Δ. Στραβοπόδη, Επίκουρο Καθηγητή Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας Παν/μίου Αθηνών (Επιβλέπων) Στον κ. Δ. Κλέτσα, Ερευνητή Α΄, Εθνικό Κέντρο Ερευνών Φυσικών Επιστημών «Δημόκριτος», Ινστιτούτο Βιολογίας, Εργαστήριο Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού και Γήρανσης Στα μέλη του Εργαστηρίου Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού και Γήρανσης Στην οικογένεια μου

Σας ευχαριστώ πολύ για την προσοχή σας