ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΗΣ GST ΣΤΗ Daphnia magna ΩΣ ΔΕΙΚΤΗ ΕΠΑΡΚΟΥΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΑΣΤΙΚΩΝ ΛΥΜΑΤΩΝ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΕΠΑΝΑΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ Αναστασία Δημητριάδη , Αθ. Ι. Παπαδόπουλος Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων-Τομέας Ζωολογίας –Τμήμα Βιολογίας ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η επεξεργασία αστικών λυμάτων είναι μία πρόσφατη, ραγδαία εξελισσόμενη τεχνολογία με στόχο την ανακύκλωση, στο μεγαλύτερο δυνατό βαθμό, των διαθέσιμων υδάτινων πόρων. Η χρήση ευαίσθητων βιοδεικτών, με στόχο τη διασφάλιση της αποτελεσματικής επεξεργασίας των αστικών λυμάτων ώστε να αποφευχθούν επιβλαβείς επιπτώσεις εξαιτίας βραχυχρόνιας αλλά και μακροχρόνιας επαναχρησιμοποίησης επεξεργασμένων λυμάτων είναι απολύτως αναγκαία για την πρόοδο της τεχνολογίας αυτής. Εδώ αναφερόμαστε στην χρησιμοποίηση φυσιολογικών παραμέτρων του υδρόβιου οργανισμού Daphnia magna ως βιοδείκτη για τον σκοπό που προαναφέραμε. Καταβάλαμε προσπάθειες ώστε να προσδιορίσουμε την επίδραση που έχουν επεξεργασμένα λύματα πάνω στην Ειδική δραστικότητα αλλά και τη σταθερά αγχιστείας της ενζυμικής οικογένειας των τρανσφερασών της γλουταθειόνης (GSTs). Διαπιστώσαμε με χρήση Western blotting κοινούς αντιγονικούς καθοριστές με το μόριο του ενζύμου των εντόμων και προχωρήσαμε στη χρήση χρωματογραφίας εστιασμού ώστε να διαπιστώσουμε εάν υφίσταται μεταβολή στην έκφραση του ισοενζυμικού προτύπου μετά από επώαση του οργανισμού για 48 ώρες.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα: Χρησιμοποιήθηκαν άτομα του γένους Daphnia magna που συλλέχτηκαν από ειδική δεξαμενή καλλιέργειας του ιχθυογεννητικού σταθμού Έδεσσας. Κινητικές παράμετροι: Η ενζυμική δραστικότητα μετρήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Habig et al., (1974) σε ολικό ομογενοποίημα. Η Km προσδιορίστηκε έναντι του υποστρώματος της GSH διατηρώντας σταθερή τη συγκέντρωση του δεύτερου υποστρώματος CDNB. Η χρωματογραφία εστιασμού πραγματοποιήθηκε σε στήλη διαστάσεων 30cm X 0,8cm σε polybuffer exchanger PBE112 (Pharmacia-Sigma) ενώ για την έκλουση των πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε Polybuffer 74 (Pharmacia-Sigma) Western blotting: Ολικό ομογενοποίημα Daphnia magna ηλεκτροφορήθηκε σύμφωνα με PAGE-SDS, μεταφέρθηκε σε νιτροκυτταρίνη και ανοσοϊανιχνεύθηκε με αντισώματα anti-GST από το έντομο Tenebrio molitor. Η εμφάνιση των συμπλόκων αντιγόνου/αντισώματος έγινε με χρήση δεύτερου αντισώματος anti-Rabbit IgG HRP-conjugated

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συγκριτική απεικόνιση της Ειδικής Δραστικότητας της GST σε ομογενοποίημα Daphnia magna που αναπτύχθηκε σε τρεις διαφορετικές συνθήκες: 1. καλλιέργεια αναφοράς (Control). 2. καλλιέργεια σε λύμα μετά από 2βάθμια επεξεργασία (2βάθμια επεξ.). 3. Καλλιέργεια σε λύμα μετά από 3βάθμια επεξεργασία (Κροκ.-Χλωρ.). Συγκριτική απεικόνιση της Κm της GST σε ομογενοποίημα Daphnia magna που αναπτύχθηκε σε τρεις διαφορετικές συνθήκες: 1. καλλιέργεια αναφοράς (Control). 2. καλλιέργεια σε λύμα μετά από 2βάθμια επεξεργασία (2βάθμια επεξ.). 3. Καλλιέργεια σε λύμα μετά από 3βάθμια επεξεργασία (Κροκ.-Χλωρ.). Ανίχνευση της ενζυμικής οικογένειας των GSTs με αντίσωμα εξειδικευμένο έναντι την συγκεκριμένης ενζυμικής οικογένειας του εντόμου Tenebrio molitor που παρασκευάστηκε στο εργαστήριό μας. Η ανίχνευση έγινε με χρήση της μεθοδολογίας Western blotting και παρουσιάζονται τα αποτελέσματα όπου χρησιμοποιήθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις από ομογενοποίημα Daphnia magna που καλλιεργήθηκε σε κανονικό νερό.

Συζήτηση/Συμπεράσματα Το σύστημα της ενζυμικής οικογένειας των GSTs στη Daphnia magna είναι πολυδύναμο όπως και στα έντομα, με τρείς κύριες ισοενζυμικές μορφές ή αναλογική έκφραση των οποίων μεταβάλλεται σε συνθήκες στρες όπως έκθεση σε δευτεροβάθμια επεξεργασμένα λύματα παρόλο που η σταθερά αγχιστείας δεν μεταβάλλεται σημαντικά όπως φαίνεται, ενώ η θνησιμότητα είναι στα ίδια επίπεδα με αυτά των κανονικών υδάτων. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προσφέρουν τα απαραίτητα δεδομένα ώστε να διερευνήσουμε σε βάθος συγκεκριμένες φυσιολογικές παραμέτρους της Daphnia magna για να χρησιμοποιηθούν ως ευαίσθητοι βιοδείκτες επαρκούς επεξεργασίας λυμάτων για επαναχρησιμοποίηση. Βιβλιογραφία Habig W. H., Pabst M. J. and Jakoby W. B. (1974) Glutathione S-transferases: the first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem. 249, 7130-7139. Kostaropoulos I., A.E. Mantzari and A.I. Papadopoulos, Alterations of some glutathione S-transferase characteristics during the development of Tenebrio molitor (Insecta: Coleoptera). Insect Biochem. Molec. Biol. 26, 963-969. (1996)