Μελέτη του πεπτικού συστήματος Πέψη υδατανθρακών Μεταφορά της γλυκόζης από το εντερικό επιθήλιο πειραματόζωα: Ινστιτούτο Παστέρ

Ένζυμα, υποστρώματα και προϊόντα του πεπτικού συστήματος

Πέψη υδατανθρακών Μεθοδολογία: εκχύλισμα στομάχου, παγκρέατος, λεπτού και παχέος εντέρου (w/v 1:30), προσθήκη σε δοκιμαστικούς σωλήνες ως εξής:

Σειρά γ (εκχύλισμα λεπτού εντέρου Μεθοδολογία Σειρά γ (εκχύλισμα λεπτού εντέρου Διαλύματα (ml) Δοκιμαστικοί σωλήνες γ1 γ2 γ3 γ4 γ5 γ6 Υπόστρωμα: 1. Αμυλο 2. Σουκρόζη 3. Μαλτόζη 4. Λακτόζη 0,5 - Ρυθμιστικό διάλυμα 1 Εκχύλισμα λεπτού εντέρου (95°C) H2O Εκχύλισμα λεπτού εντέρου (0°C) Τερματισμός της αντίδρασης με προσθήκη 1ml TCA και 0,1ml KOH. Σημειώστε το συνολικό όγκο που προκύπτει!!!

Ποσοτικός προσδιορισμός της γλυκόζης Μεταφορά δείγματος σε άλλους δοκιμαστικούς σωλήνες με τη σειρά: α5,α6,α4,α1,α2,α3………γ5,γ6,γ4,γ1,γ2,γ3 Δραστικότητα: μmoles υποστρώματος/ gr ιστού.min

Αποτελέσματα για τον υπολογισμό της ενζυμικής δραστικότητας Σειρά/ σωλήνας α β γ δ 1 0,120 0,087 2 0,040 0,106 3 0,066 0,095 4 0,080 0,206 5 0,016 0,024 6 0,028 0,068 πρότυπο

Υπολογισμοί Υπολογισμός της ποσότητας (μg) γλυκόζης στον όγκο προτύπου Αφαίρεση OD των «αντίστοιχων» μαρτύρων από κάθε σωλήνα αντίδρασης (εφόσον προκύπτει OD ≥0,05, συνεχίζουμε τους υπολογισμούς) Υπολογισμός της ποσότητας γλυκόζης στον όγκο δείγματος (0.1ml) που μεταφέρθηκε για τη «φωτομετρική μέθοδο» Υπολογισμός της ποσότητας γλυκόζης στο συνολικό όγκο (3.1 ml) –αντιστοιχεί στον όγκο εκχυλίσματος 0.5 ml Υπολογισμός της ποσότητας γλυκόζης σε 30 ml εκχυλίσματος (δηλαδή σε 1gr ιστού) Διαίρεση του προηγούμενου αποτελέσματος με το ΜΒ γλυκόζης για να μετατρέψετε μg σε μmoles Διαίρεση του προηγούμενου αποτελέσματος με τη διάρκεια επώασης Τελική αντιστοίχιση προϊόντος προς υπόστρωμα (συζήτηση στην αίθουσα και βλ. επόμενη διαφάνεια)

Διάσπαση δισακχαριτών:αντιστοιχία υποστρώματος/προϊόντος

Ποιοτική εκτίμηση της ενζυμικής δραστικότητας ++ + ++ + Ίσες?????

Μεταφορά της γλυκόζης άσκηση 14 Η ενεργός μεταφορά μπορεί να διαπιστωθεί in vitro, επωάζοντας –κλειστό- τμήμα ανεστραμμένου εντέρου με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει γλυκόζη, σε θ:37°C, παρουσία Ο2 αναστολή: Χαμηλή θερμοκρασία 2,4 δινιτροφαινόλη (DNP, επιτρέπει διαρροή πρωτονίων σε όλη την εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και παρακάπτει την συνθάση ATP) Φλωριζίνη (FL, ανταγωνιστής της μεταφοράς γλυκόζης) Ανοξία (N2)

Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice Kirk L. Hamilton , A. Grant Butt Advances in Physiology Education Published 1 December 2013 Vol. 37 no. 4, 415-426 DOI: 10.1152/advan.00017.2013

Ποια είναι η κατεύθυνση μεταφοράς γλυκόζης;

Ποια είναι η κατεύθυνση μεταφοράς γλυκόζης σε ένα τμήμα ανεστραμμένου εντέρου; Αρχικές συνθήκες: Διάλυμα Krebs εντός και εκτός του σάκου η συγκέντρωση της γλυκόζης είναι ίδια εντός και εκτός του σάκου Μετά την επώαση σε ευνοϊκές συνθήκες η συγκέντρωση της γλυκόζης στο εσωτερικό του σάκου θα αυξηθεί.

Ενεργός Μεταφορά Κάθε ομάδα : 1 Δείγμα Κ 1 Δείγμα Α Μετά το τέλος της επώασης μεταφέρουμε το διάλυμα από το εσωτερικό του σάκου ως εξής: σωλήνας Κ: δείγμα κωνικής Α: δείγμα αναστολέα

Ενεργός Μεταφορά : προσδιορισμός συγκέντρωσης γλυκόζης Αριθμός σωλήνα Δείγμα Όγκος δείγματος Η2Ο Πρότυπο διάλυμα γλυκόζης (1mg/ml) 1 - 0,02 2 3 Κωνικής (Ο2 εσωτερικό) 4 Αναστολέα (εσωτερικό) 5 Αρχικό διάλυμα Krebs Προσθήκη μίγματος αντιδραστηρίων για τη γλυκόζη (ΣΑΚΧΑΡΟ), 2,5 ml, επώαση, φωτομέτρηση

Ενεργός Μεταφορά Υπολογισμοί: Η μεταφορά πραγματοποιείται προς το εσωτερικό του σάκου –εφόσον οι συνθήκες είναι κατάλληλες. Έστω Χ η συγκέντρωση της γλυκόζης στο δείγμα και Ψ η συγκέντρωσή της στο αρχικό διάλυμα Krebs (Χ-Ψ)/45΄= οι “μονάδες συγκέντρωσης” που μεταφέρονται κάθε λεπτό