ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΩΝ ΣΕ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ 2-ΧΛΩΡΟΦΑΙΝΟΛΗΣ (2-CP) Ιωάννης Θεοδωρίδης, Δημήτρης Βλαστός* Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Γ. Σεφέρη 2-30100 Αγρίνιο, *e-mail: dvlastos@cc.uoi.gr ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η 2-χλωροφαινόλη (2-CP) αποτελεί έναν διαδεδομένο ρυπαντή υδάτινων οικοσυστημάτων και προέρχεται κυρίως από τις βιομηχανίες επεξεργασίας χαρτιού και παρασκευής φυτοφαρμάκων. Χαρακτηρίζεται από τη παρουσία ενός μορίου χλωρίου στη θέση 2 του φαινολικού δακτυλίου. Η τεχνική των μικροπυρήνων (ΜΝ) εφαρμόζεται πάνω από 25 χρόνια ως δείκτης προσδιορισμού κυτταρογενετικής βλάβης. Τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί και σε ερυθροκύτταρα ψαριών, με δεδομένο ότι τα ψάρια αποτελούν κατάλληλους βιοδείκτες προσδιορισμού γενοτοξικών επιδράσεων των περιβαλλοντικών ρυπαντών σε υδάτινα οικοσυστήματα. Οι MN, σχηματίζονται από τη συμπύκνωση άκεντρων χρωμοσωμικών θραυσμάτων ή από ολόκληρα χρωμοσώματα που δεν ενσωματώθηκαν στον κυρίως πυρήνα κατά την ανάφαση. Η παρούσα μελέτη αφορά την επαγωγή ΜΝ σε ερυθροκύτταρα ψαριών Carassius auratus auratus στα οποία χορηγήθηκε τροφή η οποία είχε εμποτιστεί σε υδατικά διαλύματα 5 και 10 mg/L 2-CP. Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 35 ψάρια (7 ομάδες των 5 ψαριών) όπου η μία ομάδα αντιστοιχούσε στον αρνητικό μάρτυρα (control), ενώ οι υπόλοιπες 6 ομάδες δέχτηκαν την επίδραση 5 και 10 mg/L 2-CP σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (24, 48 και 72 ώρες). Η χορήγηση της εμποτισμένης με 2-CP τροφής γινόταν δύο φορές ανά 24 ώρες ενώ πριν και μετά τη χορήγηση καταγραφόταν το σωματικό βάρος των ψαριών.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΖΥΓΙΣΗ ΨΑΡΙΟΥ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΕΠΙΣΤΡΩΣΗ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΕ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟΦΟΡΟΥΣ ΠΛΑΚΕΣ - ΣΤΕΓΝΩΜΑ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΜΕΘΑΝΟΛΗΣ ΓΙΑ 20΄ - ΣΤΕΓΝΩΜΑ ΧΡΩΣΗ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ 10% Giemsa-Sorensen’s buffer ΞΕΠΛΥΜΑ ΣΕ ΝΕΡΟ - ΣΤΕΓΝΩΜΑ ΚΛΕΙΣΙΜΟ ΜΕ ΚΑΛΥΠΤΡΙΔΑ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ (100x) ΑΝΑΛΥΣΗ 1000 ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΝΑ ΨΑΡΙ ΤΟΠΟΘΕΤΗΣΗ ΣΕ ΑΤΟΜΙΚΑ ΔΟΧΕΙΑ ΕΚΤΡΟΦΗΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΕΜΠΟΤΙΣΜΕΝΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΜΕ 2-CP ΔΥΟ ΦΟΡΕΣ ΑΝΑ 24 ΩΡΕΣ ΑΝΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΨΑΡΙΟΥ Επίδραση με γαρυφαλέλαιο (1 σταγόνα / δοχείο νερού) Παραμονή του ψαριού για 10΄ ΖΥΓΙΣΗ ΨΑΡΙΟΥ ΤΟ ΕΝΥΔΡΕΙΟ ΜΑΣ (125 lt / 60x50x45.5 cm)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Βάρη ψαριών (gr) Control 5 mg/kg 2-CP 10 mg/kg 2-CP Αρχικό βάρος Τελικό βάρος 24 ώρες 48 ώρες 72 ώρες 7,42 ± 0,93 7,68 ± 0,98 7,19 ± 0,63 7,41 ± 0,62 8,55 ± 0,81 7,54 ± 0,78 8,74 ± 0,93 8,42 ± 0,93 4,92 ± 0,24 5,00 ± 0,24 7,17 ± 0,51 6,97 ± 0,53 6,22 ± 0,75 6,02 ± 0,77 Μικροπυρήνες (ΜΝ) Control 5 mg/kg 2-CP 10 mg/kg 2-CP 24 ώρες 48 ώρες 72 ώρες 7.2 ± 0.73 9.2 ± 0.86 13.6 ± 1.21* 18 ± 0.71** 15.8 ± 0.58** 24.2 ± 2.73** 40 ± 6.26** * p≤0.05, ** p≤0.001 (Student’s t -test) ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΕΣ Οι MN στα ψάρια (α,β,γ) είναι μικρότεροι σε μέγεθος (1/10 έως 1/30 του μεγέθους του κύριου πυρήνα) συγκρινόμενοι με τα μεγέθη των μικροπυρήνων που ανιχνεύονται σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα (δ) ενώ έχουν παρόμοιο μέγεθος με τους ΜΝ που παρατηρούνται σε κύτταρα μυελού των οστών τρωκτικών (ε) α β γ δ ε ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΕΣ Οι MN στα ψάρια (α,β,γ) είναι μικρότεροι σε μέγεθος (1/10 έως 1/30 του μεγέθους του κύριου πυρήνα) συγκρινόμενοι με τα μεγέθη των μικροπυρήνων που ανιχνεύονται σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα (δ) ενώ έχουν παρόμοιο μέγεθος με τους ΜΝ που παρατηρούνται σε κύτταρα μυελού των οστών τρωκτικών (ε) α β γ δ ε ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΕΣ Οι MN στα ψάρια (α,β,γ) είναι μικρότεροι σε μέγεθος (1/10 έως 1/30 του μεγέθους του κύριου πυρήνα) συγκρινόμενοι με τα μεγέθη των μικροπυρήνων που ανιχνεύονται σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα (δ) ενώ έχουν παρόμοιο μέγεθος με τους ΜΝ που παρατηρούνται σε κύτταρα μυελού των οστών τρωκτικών (ε) α β γ δ ε

Αριθμός Μικροπυρήνων (ΜΝ) Μετρήσεις βάρους ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ …η συνέχεια… Αριθμός Μικροπυρήνων (ΜΝ)

ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συνολικά στα πειράματα μας χρησιμοποιήθηκαν 35 ψάρια του υποείδους Carassius auratus auratus (7 ομάδες των 5 ψαριών). 1 ομάδα ως αρνητικός μάρτυρας (control). 3 ομάδες με χορήγηση τροφής εμποτισμένης σε υδατικό διάλυμα 2-CP 5mg/Kg για 3 διαφορετικά χρονικά διαστήματα: 24, 48 και 72 ώρες. 3 ομάδες με χορήγηση τροφής εμποτισμένης σε υδατικό διάλυμα 2-CP 10mg/Kg για 3 διαφορετικά χρονικά διαστήματα: 24, 48 και 72 ώρες. Εξετάστηκαν 35000 ερυθροκύτταρα ψαριών (1000 / ψάρι) και πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων με την εφαρμογή του Student’s t-test. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΑΜΕ: Μικρή αύξηση του τελικού σωματικού βάρους των ψαριών και στις δύο εξεταζόμενες συγκεντρώσεις στο χρονικό διάστημα των 24 ωρών. Μείωση του τελικού σωματικού βάρους και στις δύο εξεταζόμενες συγκεντρώσεις για τις χρονικές περιόδους των 48 και 72 ωρών (κατά αναλογία με τη συγκέντρωση της 2-CP και του χρόνου χορήγησης). Στη συγκέντρωση των 5 mg/Kg στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων στις 48 ώρες (p≤0.05) και στις 72ώρες (p≤0.001). Στη συγκέντρωση των 10mg/Kg στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων σε όλες τις εξεταζόμενες χρονικές περιόδους (p≤0.001). Η μελέτη των γενοτοξικών επιδράσεων της 2-CP σε ψάρια συνεχίζεται με διαφορετικές εξεταζόμενες συγκεντρώσεις και χρόνους επίδρασης.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΟΥΜΕ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΑΣ ! Ιωάννης Θεοδωρίδης-Περιβαλλοντολόγος Δημήτρης Βλαστός*-Λέκτορας Περιβαλλοντικής Μεταλλαξιγένεσης Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Γ. Σεφέρη 2-30100 Αγρίνιο, *e-mail: dvlastos@cc.uoi.gr