ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

GRAM ΘΕΤΙΚΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙA Gram θετικά βακτηρίδια σπορογόνα (Clostridium sp) Gram θετικοί αναερόβιοι κόκκοι Peptostreptococcus sp P. anaerobius Parvimonas sp P. micra Finegoldia sp F. magna Peptoniphillus sp Pn. asaccharolyticus, Pn. indolicus, Pn. harei, Pn. lacrimalis, Pn. ivorii Anaerococcus sp An. prevotii, An. Tetradius, An. hydrogenalis, An. octavius An. lactolyticus, An. vaginalis Peptocoocus sp P. niger Atopobium sp A. parvula Coprococcus sp, Rominococcus sp Sarcina sp ,Gallicola sp Gallicilo bamesae Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα (Actimomyces sp, Propionibacterium sp, Lactobacillus sp, Bifidobacterium sp, Eubacterium sp )

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Α. Κλινικές πληροφορίες Β. Μακροσκοπική εξέταση Γ. Άμεση μικροσκοπική εξέταση Δ. Ταυτοποίηση (προκαταρκτική & τελική)

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ (συνέχεια) Α. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ 1. Θέση λοίμωξης 2. Προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών 3. Παραγωγή αερίου 4. Δυσοσμία

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ B. Μακροσκοπική εξέταση Μαύρα πυώδη ή αιματηρά εξιδρώματα Πιθανόν φθορισμός Κοκκία θείου

Χρώση Gram: Θέτει την αρχική υποψία της παρουσίας αναεροβίων βακτηρίων Γ. ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Νωπό: Μικροσκόπηση σε σκοτεινό πεδίο για παρατήρηση των σπόρων και της κινητικότητας Χρώση Gram: Θέτει την αρχική υποψία της παρουσίας αναεροβίων βακτηρίων Προσφέρει σημαντική βοήθεια στην αρχική εμπειρική θεραπεία

Χλωρίδα εντέρου

Lactobacillus sp

Θρεπτικά υλικά για αναερόβια Brucella blood agar εμπλουτισμένο με αιμίνη και βιταμίνη Κ1 Phenyl ethyl alcohol blood agar (PEA) kanamycin-vancomycin laked blood agar (KVLB) Bacteroides bile-esculin agar (BBE) Thioglycolate broth εμπλουτισμένο με βιταμίνη K1 και αιμίνη

Δ. Προκαταρκτική ταυτοποίηση αναεροβίων Mορφολογία των αποικιών Xρώση Gram Aπλές δοκιμασίες Πλήρης ταυτοποίηση Βιοχημικές δοκιμασίες Συστήματα ταυτοποίησης (Rapid ID 32A, BBL Crystal ANR, RapID ANA II ) Δισκία ενζυματικών αντιδράσεων Υγρή-αέρια χρωματογραφία

Εξέταση των καλλιεργημάτων Συνήθως πολυμικροβιακή ανάπτυξη με άλλα αναερόβια και αερόβια Ενδείξεις αναεροβίων: Δυσοσμία Περισσότεροι τύποι αποικιών στο αιματούχο αναερόβιο από το σοκολατόχρωμο Ανάπτυξη στο υλικό ΒΒΕ ή στο KVLB Κεραμιδί φθορισμός (μετά έκθεση σε UV φως 366 nm) ή μαύρες αποικίες στο KVLB ή στο αιματούχο αναερόβιο Από κάθε διαφορετικό μορφότυπο αποικίας εκτελείται χρώση Gram, έλεγχος αεροβιώσεως σε σοκολατόχρωμο άγαρ (24-48 h CO2 5-10%) και απομόνωση σε αιματούχο ανερόβιο με δισκίο metronodazole Ανάπτυξη μόνο στο αιματούχο αναερόβιο σημαίνει αναερόβιο βακτήριο Μερικά αναερόβια αναπτύσσονται σε περιβάλλον CO2 5-10%

ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΓΡΗΓΟΡΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ Clostridium sp (από καθαρό καλλιέργημα) Χρώση Gram Μορφολογία αποικιών Έλεγχος αεροβίωσης Δίσκοι ειδικής περιεκτικότητας (Vancomycin 5 μg, Kanamycin 1000 μg, Colistin 10 μg) Λιπάση –Λεκιθινάση Παραγωγή ινδόλης Αναγωγή νιτρικών δισκία Καταλάση Φθορισμός Παραγωγή ουρεάσης Δοκιμασία παραγωγής σπόρων (alcohol shock) Ανάστροφη CAMP Nagler test

Χαρακτηριστικά αποικιών κλωστηριδίων Μεγάλες αποικίες με διπλή ζώνη αιμόλυσης (C. perfringens, C.novyi ) Μεγάλες ριζοειδείς ( Clostridium sp ) Ερπύζουσες αποικίες (C. septicum, C. tetani, C. sordellii, C. sporogenes) Οσμή (στάβλου αλόγων C. difficile) Χρώμα αποικιών

C. novyi

C. difficile

C. septicum

ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΠΟΡΟΓΟΝΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ C. difficile κιτρινοπράσινος C. innocuum C. ramosum κόκκινος

Μικροσκοπική εικόνα C. perfringens: Gram (+) βακτηρίδια μεγάλα με τετραγωνισμένα άκρα, χωρίς σπόρους C. septicum: Μακρύ, λεπτό, πολύμορφο νηματοειδές με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. novyi : Mεσαίου μεγέθους με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. difficile: Μακρύ, λεπτό, με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους

C. perfringens

C. difficile

C. difficile

C. sporogenes

C. novyi

C. tetani

C. septicum

Λεκιθινάση + C. perfringens

Λιπάση + C. sporogenes

C. perfringens Ανάστροφη δοκιμασία CAMP

Nagler test Αντιτοξίνη C. perfrringens

ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Ινδόλη Νιτρικά Φθορισμός Λεκιθινάση Λιπάση Ουρεάση Τετράγωνα άκρα Διπλή β-αιμόλυση C. perfringens - - + + C. bifermentans C. sordellii C. septicum C. sporogenes

Προκαταρκτική ταυτοποίηση κλωστηριδίων + - Λεκιθινάση + - + Λιπάση - + Λιπάση - C. bifermenntas C. sordelli C. barati C. limosum C. perfringens C. sporogenes Closridium sp C. novyi + - Ινδόλη C. bifermenntas C. sordelli C. barati + Ζελατίνη - C. limosum C. perfringens + - Ουρεάση C. limosum C. perfringens C. barati C. sordelli C. bifermenntas

ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΕΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΕΣ ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΕΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ Ένζυμα Θετικό αποτέλεσμα Βακτήρια Glutamic acid decarboxylase amine (μπλε χρώμα) C. sordelii (+) C. bifermentans (-) L-proline aminopeptedase β-naphythylamine + cinnamaldehyde ( ροζ-πορφυρό χρώμα) C. difficile (+) C. innocuum (-) α-Glucosidase μπλε φθορισμός (με UV 360 nm) 4-methylumbelliferone C. septicum (+) C. sporogenes (-) Αλκαλική φωσφατάση 4- nitrophenol Κίτρινο χρώμα An. hydrogenalis (+) An. accacharolyticus (-)

Σακχαρολυτικά – πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεθινά ση Λιπά Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικότητα Θέση σπόρων Εσκουλίνη C. bifermentans + - ΩΥ C. Sordelii +- C. perfringens Οχι C. novyi C. sporogenes C. cadaveris C Septicum Π C. difficile ΩΤ C. putrificum Τ -+

Σακχαρολυτικά – μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεκιθι νάση Λιπάση Ινδό λη Αερό βια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκου λίνη C. barati + - Τελικός ΟΧΙ C. tertium AN C. butyricum ΩΤ C. innocum C. ramosum Σ, ΩΤ Σπάνιος C Clostridioform +_ ΩΥ, ΟΧΙ

Μη σακχαρολυτικά – μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεκιθινάση Λιπάση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλίνη C. tetani - Π + Σ,Τ C. hastiform _+ Υ C. Subterminale -+ ΩΥ, ΟΧΙ C. histoyticum +- ΩΥ C. limosum

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΚΟΚΚΩΝ Δίσκοι SPS E A Peptostreptococcus anaerobius - Ινδόλη + + - Ουρεάση Pn. asaccharolyticus An. hydrogenalis Micromonas micros <0,6 μm Finegoldia magna > 0,6 μm An. prevotii An. terradius Αλκαλική φωσφατάση ή ζύμωση γλυκόζης - + - + - α-γαλακτοσιδάση Pn.αsaccharolyticus An. tetradius An. hydrogenalis An. prevotii

P. anaerobius

Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα A. israeli Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα

A. israeli

A. odondolyticus

Propionibacterium acnes

Προκαταρκτική ταυτοποίηση Gram (+) Μη σπορογόνων βακτηριδίων

Ερώτηση 1η Gram θετικό, σπορογόνο αναερόβιο βακτηρίδιο, (απομονώθηκε από κ/α αποστήματος σε χρήστη ενδοφλεβίων ναρκωτικών ουσιών) με: διπλή ζώνη β- αιμόλυσης λεκιθινάση( +) λιπάση (+) είναι: 1. C. perfringens 2. C. sporogenes 3. C. novyi 4. Όλα τα ανωτέρω

Ερώτηση 2η Gram (+) αναερόβιος κόκκος, ευαίσθητος στη Metronidazole με ζώνη αναστολής στο SPS >= 12 mm είναι: 1. Micromonas micros 2. Pertosrteptococcus anaerobius 3. Finegoldia magna 4. Όλα τα ανωτέρω

Καλό καλοκαίρι

`

Ταυτοποίηση Gram-αρνητικών αναεροβίων βακτηρίων

Ταυτοποίηση Gram-αρνητικών αναεροβίων Είναι εφικτή η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους; Είναι κλινικά σημαντική η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους; Μπορεί ένα κλινικό εργαστήριο χρησιμοποιώντας απλά συστήματα και μεθόδους να φτάνει σε ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους;

Gram-αρνητικά αναερόβια Bacteroides spp. (fragilis group και non-fragilis), Prevotella spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp. Αναερόβια Gram-αρνητικά βακτήρια κινητά Butyrivibrio, Succinivibrio, Campylobacter rectus, Selemonas, Anaerobiospirillum Αναερόβιοι Gram-αρνητικοί κόκκοι Veillonella spp.

Προκαταρτική ταυτοποίηση Έλεγχος αεροβιωσης Χρώση κατά Gram Μορφολογία αποικιών στην καλλιέργεια Παραγωγή χρωστικής Δισκία ειδικής περιεκτικότητας (Vancomycin 5 μg, Kanamycin 1000 μg, Colistin 10 μg, SPS) Ταχείες δοκιμασίες καταλάσης και ινδόλης Ανάπτυξη παρουσία χολής 20% (Bacteroides Bile Esculin άγαρ) Δοκιμασίες λιπάσης-λεκιθινάσης (ανάπτυξη σε υλικό egg-yolk άγαρ)

Δισκία ειδικής περιεκτικότητας Van Kan Col Bacteroides fragilis group Α Bacteroides ureolyticus A E Prevotella spp. Α/Ε Fusobacterium spp. Porphyromonas spp. Veillonella spp.

Δισκία ειδικής περιεκτικότητας

Συνοπτική ταυτοποίηση Gram-αρνητικών Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Χαρακτηριστικά των ανθεκτικών στην χολή Bacteroides spp. (B Χαρακτηριστικά των ανθεκτικών στην χολή Bacteroides spp. (B. fragilis group και B. splanchnicus) Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Διαφορές στην αντίδραση της εσκουλίνης και την ανάπτυξη στο BBE Bacteroides fragilis Ανάπτυξη (+) Μαύρες αποικίες Μαύρισμα του υλικού Bacteroides vulgatus Ανάπτυξη (+) Άχρωμες αποικίες Υλικό χωρίς αλλαγή Bilophila wadsworthia Ανάπτυξη (+) αργή Αποικίες με μαύρο κέντρο Μαύρισμα του υλικού

Ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους των ανθεκτικών στην χολή Bacteroides spp Ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους των ανθεκτικών στην χολή Bacteroides spp. (B. fragilis group και B. splanchnicus) Ινδόλη (+) Ινδόλη (-) Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Δοκιμασία ινδόλης σε σταγόνα (spot indole test) Αρνητικό αποτέλεσμα Bacteroides fragilis Θετικό αποτέλεσμα Bacteroides thetaiotaomicron Θετικό αποτέλεσμα Prevotella intermedia Κάλυψη αντίδρασης από την χρωστική

Ανθεκτικά στην χολή Gram-αρνητικά Είδος Kan Col Van Ind Nit Urea B. fragilis R - Bilophila S + Sutterella Tissierella ± F. varium

B. fragilis aιματούχο άγαρ B. fragilis Gram χρώση B. fragilis προκαταρτική

Συνοπτική ταυτοποίηση Gram-αρνητικών Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Συνοπτική ταυτοποίηση των ευαίσθητων στην χολή Gram-αρνητικών βακτηρίων Μη χρωμογόνα Χρωμογόνα Σακχαρολυτικά Ασακχαρολυτικά Ασακχαρολυτικά Σακχαρολυτικά Prevotella spp. Porphyromonas spp. Prevotella spp. Selemonas spp. Capnocytophaga spp. Bacteroides spp. Campylobacter spp. Bilophila, Sutterella Tissierella

Χαρακτηριστικά των μη χρωμογόνων σακχαρολυτικών Gram-αρνητικών στελεχών Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους των μη χρωμογόνων σακχαρολυτικών Gram-αρνητικών στελεχών Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Σακχαρολυτικά μη χρωμογόνα Είδος Ινδόλη Εσκουλίνη b-NAG a-fucos b-xylos Col P. buccae - + S P. oris R P. oralis R/s P. enoeca ± P. bivia P. disiens

Χαρακτηριστικά των μη χρωμογόνων ασακχαρολυτικών Gram-αρνητικών στελεχών Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

B. ureolyticus aιματούχο άγαρ

Ασακχαρολυτικά μη χρωμογόνα Είδος Χολή Ουρία Κιν/τα Καταλάση B. capillosus / gracilis S/R - B. ureolyticus S + Sutterella R Tissierella C. rectus re

Χαρακτηριστικά των χρωμογόνων Gram-αρνητικών στελεχών (Prevotella και Porphyromonas spp) Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους των χρωμογόνων Gram-αρνητικών στελεχών (Prevotella και Porphyromonas spp) Ασακχαρολυτικά Porphyromonas spp. Σακχαρολυτικά Prevotella spp. Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Αιματούχο Prevotella spp. Διαφορά στην παραγωγή χρωστικής ανάλογα το υλικό Αίμα κονίκλου  γρηγορότερη ανάπτυξη χρωστικής KVLB Prevotella spp. παραγωγή χρωστικής Παραγωγή χρωστικής

Prevotella dentalis Παραγωγή χρωστικής (-) Αποικίες βλεννώδεις σαν σταγόνα Prevotella pallens Παραγωγή χρωστικής (±) Prevotella catoniae Παραγωγή χρωστικής (-) Porphyromonas spp. Παραγωγή χρωστικής (+) Αποικίες βλεννώδεις

Χαρακτηριστικά και ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους των στελεχών Fusobacterium spp Λιπάση (-), μη αιμολυτικά στελέχη F. necrophorum  F. pseudonecrophorum  F. varium Wadsworth – KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 2004

Αντιδράσεις λιπάσης – λεκιθινάσης Αντίδραση λιπάσης Η αντίδραση φαίνεται στην επιφάνεια του άγαρ σαν μαργαριταροειδής επίστρωση Αντίδραση λεκιθινάσης Η αντίδραση φαίνεται στο εσωτερικό του άγαρ σαν θόλωση του υλικού

Fusobacterium spp. Είδος Ινδόλη Λιπάση Εσκουλίνη Χολή ONPG F. nucleatum + - S F. necrophorum F. varium R F. mortiferum ±

F. nucleatum subsp. polymorphum F. nucleatum subsp. nucleatum F. nucleatum subsp. fusiforme F. necrophorum

F. nucleatum Gram χρώση F. necrophorum Gram χρώση F. mortiferum Gram χρώση

Ταυτοποιητικά συστήματα του εμπορίου Βιοχημικά σε βυθίσματα (24ωρα) API 20A (bioMerieux)  για σακχαρολυτικά, ταχέως αναπτυσσόμενα (Bacteroides fragilis group, Prevotella spp.) Ενζυμικά σε βυθίσματα (2 – 4ωρα) Rapid ID 32A (bioMerieux), BBL Crystal ANR ID (Becton Dickinson), RapID ANA II (Remel), MicroScan ANA (Microscan) Μεμονωμένα ενζυμικά δισκία (2 – 24ωρα) Rosco Diagnostic Tablets (Rosco)  φθηνότερα και ευέλικτα, χρήση όσων απαιτούνται κάθε φορά, προϋποτίθεται εμπειρία.

Συνήθη προβλήματα στα συστήματα του εμπορίου Πολύ αραιό εναιώρημα Προετοιμασία εναιωρήματος από παλιό καλλιέργημα Λάθη και παραλήψεις στην προσθήκη του λαδιού πριν την επώαση ή στην προσθήκη των αντιδραστηρίων πριν την ανάγνωση Ασθενείς αντιδράσεις (ειδικά όσες απαιτούν UV φως για την ανάγνωση και σύγκριση με τον μάρτυρα)

Συνήθη ταυτοποιητικά λάθη Bilophila wadsworthia  Bacteroides ureolyticus (δεν έγινε δοκιμασία καταλάσης) Bilophila wadsworthia  Desulfvibrio (δεν έγινε δοκιμασία κινητικότητας) S. wadsworthensis  Bacteroides gracilis (δεν έγινε δοκιμασία ανάπτυξης παρουσία χολής) Bacteroides fragilis  Prevotella oralis (δεν έγινε δοκιμασία ανάπτυξης παρουσία χολής)

Συνοπτική καταγραφή δοκιμασιών Χαρακτηριστικά αποικιών, παραγωγή χρωστικής, φθορισμός μετά από έκθεση σε UV. Δισκία ειδικής περιεκτικότητας Δοκιμασία ανάπτυξης παρουσία χολής Δοκιμασία λιπάσης (egg yolk agar) Χαρακτηριστικά ενζυμικών και σακχαρολυτικών αντιδράσεων στα ταυτοποιητικά συστήματα εμπορίου.

Άλλες μέθοδοι ταυτοποίησης Υγρή-αέρια χρωματογραφία Χρωματογραφία λιπαρών και οργανικών μεταβολικών οξέων Τελικά προϊόντα του μεταβολισμού της γλυκόζης (μικρές αλυσίδες) Η ποσότητα, το είδος και η αναλογία είναι ειδικά του είδους, κυρίως στους Gram-θετικούς αναερόβιους κόκκους Χρωματογραφία μακρών λιπαρών οξέων της κυτταρικής μεμβράνης (FAME analysis) Δομικά στοιχεία της κυτταρικής μεμβράνης Η ποσότητα, το είδος και η αναλογία είναι ειδικά του είδους σε όλα τα αναερόβια

Συμπεράσματα Η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους, τουλάχιστον για τα σημαντικότερα και συχνότερα απομονούμενα είδη Gram-αρνητικών αναεροβίων, είναι εφικτή στο κλινικό εργαστήριο ενός τριτοβάθμιου νοσοκομείου χρησιμοποιώντας λίγες σχετικά δοκιμασίες Τα μειονεκτήματα, οι αδυναμίες και οι περιορισμοί των έτοιμων εμπορικών συστημάτων θα πρέπει να είναι γνωστά, έτσι ώστε να αποφεύγονται λάθη ή καθυστερήσεις στην ταυτοποίηση, που μπορεί να οδηγήσουν σε εσφαλμένες επιλογές θεραπείας

Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας