ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 1973 ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΧΡΗΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ως οχημάτων μεταφοράς DNA ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ οδήγησε στη λήψη μεγάλων ποσοτήτων DNA που διευκόλυνε τη μελέτη του.

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Βοηθούν και στη μελέτη των πρωτεινών καθώς επιτρέπουν – μέσω κλωνοποίησης και έκφρασης των γονιδίων – τη λήψη μεγάλων ποσοτήτων από αυτές.

ΚΥΡΙΩΤΕΡΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Μ. Β. ΚΥΡΙΩΤΕΡΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Μ. Β. ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ Τέμνουν το DNA ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ - ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΩΝ DNA Ένα κομμάτι του DNA μετά την είσοδό του σε πλασμίδιο ή ιό, μπορεί να εισαχθεί σε οργανισμό (προκαρυωτικό ή ευκαρυωτικό) να πολλαπλασιαστεί σε μεγάλο βαθμό, να εξαχθεί και να μελετηθεί.

ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Μας επιτρέπει να εντοπίσουμε ειδικές αλληλουχίες DNA ή RNA, χάρη στην ικανότητά τους να ‘κολλάνε΄’ σε μία συμπληρωματική τους αλληλουχία όταν ευρίσκονται σε μονόκλωνη μορφή.

ΣΗΜΑΝΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΤΩΝ Τμήματα DNA, συνθετικά ολιγομερή ή RNA μπορεί να σημανθούν με ραδιενεργές ή φθορίζουσες ουσίες και να χρησιμοποιηθούν ως ‘ανιχνευτές’ σε πειράματα υβριδισμού.

ΤΈΧΝΙΚΗ ΤΟΥ SEQUENCING Επιτρέπει να διαβάσουμε βάση προς βάση την αλληλουχία του DNA

ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΟΥ SOUTHERN Το στύπωμα κατά Southern μας επιτρέπει τον έλεγχο της ακεραιότητας του DNA

ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ PCR Επιτρέπει τον τοπικό πολλαπλασιασμό τμήματος DNA και τη λήψη ικανοποιητικής ποσότητας από αυτό.

Ηλεκτροφόρηση DNA

Λήψη ποσότητας DNA από κλώνο

Δημιουργία γενωμικής βιβλιοθήκης

Yβριδισμός νουκλεϊκών οξέων Αρχή του υβριδισμού Υβριδοποίηση ή υβριδισμός Δημιουργία δίκλωνου από οποιαδήποτε δύο συμληρωματικά μονόκλωνα μόρια DNA ή RNA Τι είναι υβριδισμός: επαναδιάταξη αποδιάταξη 21

Ο υβριδισμός νουκλεϊκών οξέων είναι η βάση για αρκετές εφαρμογές: Αποτύπωση κατά SOUTHERN Ιn situ υβριδοποίηση σε χρωμοσώματα & micro-arrays 1. Ανίχνευση τμημάτων DNA (γονιδίων, πολυμορφισμών) : Αποτύπωση κατά NORTHERN Ιn situ υβριδοποίηση & micro-arrays 2. Ανίχνευση RNA-μεταγράφων (mRNAs): 22

Ανίχνευση κλώνων βιβλιοθήκης

cDNA κλώνοι

Φορέας έκφρασης- Βιοτεχνολογία

DNA -Πρωτείνη

Σημάνσεις ανιχνευτών (ιχνηθετών)

ASO PROBES Allele Specific Oligonucleotide

Τεχνική διαβάσματος νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Sequencing

Τεχνική αποτύπωσης κατά Southern ή Northern Στην αποτύπωση κατά Southern ηλεκτροφορούμε & αποτυπώνουμε DNA. Ανιχνευτής: DNA Στην αποτύπωση κατά Northern ηλεκτροφορούμε & αποτυπώνουμε RNA. Ανιχνευτής: RNA (ή DNA) 45

Αποτύπωσης κατά SOUTHERN Εφαρμογές Αποτύπωσης κατά SOUTHERN Ανίχνευση: Γονιδίων (έλεγχος για μεταλλάξεις) Πολυμορφισμών (προγεννητικός έλεγχος, πατρότητας, δραστών κλπ) Εφαρμογές Αποτύπωσης κατά NORTHERN ή in situ Ανίχνευση: των RNA-μεταγράφων (έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης) Οι παραπάνω εφαρμογές γίνονται πλέον και με PCR 46

PCR T i m e 30x Temperature Melting 94 oC Extension Annealing Primers 100 50 T i m e 30x 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’

DNA Replication and the Polymerase Chain Reaction

History The Polymerase Chain Reaction (PCR) was not a discovery, but rather an invention A special DNA polymerase (Taq) is used to make many copies of a short length of DNA (100-10,000 bp) defined by primers Kary Mullis, the inventor of PCR, was awarded the 1993 Nobel Prize in Chemistry

What PCR Can Do PCR can be used to make many copies of any DNA that is supplied as a template Starting with one original copy an almost infinite number of copies can be made using PCR “Amplified” fragments of DNA can be sequenced, cloned, probed or sized using electrophoresis Defective genes can be amplified to diagnose any number of illnesses Genes from pathogens can be amplified to identify them (ie. HIV) Amplified fragments can act as genetic fingerprints

How PCR Works PCR is an artificial way of doing DNA replication Instead of replicating all the DNA present, only a small segment is replicated, but this small segment is replicated many times As in replication, PCR involves: Melting DNA Priming Polymerization

Initiation - Forming the Replication Eye Origin of Replication 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’

Extension - The Replication Fork 5’ 3’ Primase Single strand binding proteins Laging Strand 3’ 5’ 5’ 3’ Okazaki fragment RNA Primers DNA Polymerase Helicase Leading Strand 5’

Components of a PCR Reaction Buffer (containing Mg++) Template DNA 2 Primers that flank the fragment of DNA to be amplified dNTPs Taq DNA Polymerase (or another thermally stable DNA polymerase)

PCR T i m e 30x Temperature Melting 94 oC Melting 94 oC Annealing 100 50 T i m e Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

PCR Temperature 100 50 T i m e Melting 94 oC 5’ 3’

PCR Temperature 100 50 T i m e Melting 94 oC 5’ 3’ Heat 5’ 3’

PCR T i m e Temperature Melting Melting 94 oC 94 oC Extension 100 50 T i m e Melting 94 oC Melting 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

PCR T i m e Heat Heat 30x Temperature Melting 94 oC Extension Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC Temperature 100 50 T i m e 30x 5’ 3’ Heat 5’ 5’ Heat 5’ 3’ 5’

DNA Between The Primers Doubles With Each Thermal Cycle Cycles Number 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64

More Cycles = More DNA Number of cycles 0 10 15 20 25 30 Size Marker

Εκκινητές για το RNA του HIV ανίχνευση RNA-ιού με RT-PCR Απομόνωση των RNAs Όχι σήμα RNAs Εκκινητές για το RNA του HIV 72

Χρήση της τεχνικής PCR στην ανίχνευση πολυμορφισμών Εφαρμογές στην Ιατροδικαστική για έλεγχο δειγμάτων & πατρότητας

Micro chips Μικροσυστοιχίες Επιτρέπει τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων. Είτε σε διαφορετικά κύτταρα/ιστούς Είτε σε διαφορετική φάση ανάπτυξης.

Μικροσυστοιχίες γονιδίων _ microarrays Δύο ειδών πλακίδια (μικροσυστοιχίες): 1] ολιγονουκλεοτιδίων (DNA chips) 25μερή νουκλεοτιδίων συντίθενται in situ στη γυάλινη επιφάνεια, με τεχνική ανάλογη της φωτο-λιθογραφίας. Μέχρι 400.000 διαφορετικές αλληλουχίες που αντιπροσωπεύουν 18.000 γονίδια μπορούν να συντεθούν σε επιφάνεια 1,3χ1,3 cm! 2] cDNA cDNA τμήματα (μήκους1Kb) συνδέονται με ειδικό ρομπότ στην επιφάνεια του γυαλιού. Ένα τυπικό πλακίδιο 2χ2 cm περιλαμβάνει περίπου 6.000 θέσεις εμφύτευσης 78

Η χρήση μικροσυστοιχιών cDNA μας επιτρέπει να συγκρίνουμε μαζικά τη γονιδιακή έκφραση Για σύγκριση δύο πληθυσμών mRNA: σήμανση με διαφορετικά φθοριοχρώματα Υβριδοποίηση με το cDNA της πλάκας Σάρωση και επεξεργασία του σήματος 79

Fluorescent In-situ Hybridisation FISH 81

Διαγονιδιακά ζώα