Ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά των Διαύλων Ι Τασεοευαίσθητοι δίαυλοι Na+, K+, Ca2+ Χ. Λαμπρακάκης 2014

Περιεχόμενα Οι καταστάσεις του διαύλου Χαρακτηριστικά του ρεύματος που διαπερνά μεμονομένο δίαυλο Σύγκριση με το ρεύμα που διαπερνά ενα σύνολο διαύλων Ιδιότητες και χαρακτηριστικά των τασεοευαίσθητων διαύλων Na+, K+, Ca2+ η απενεργοποισηση διαύλων Na+, Ca2+ τύποι διαύλων Ca2+ αργοπορημένο ρεύμα K+ δίαυλοι K+ ευαίσθητοι στο ενδοκυττάριο Ca2+

τυχαίες μεταπτώσεις απο μηδενικό ρεύμα σε μέγιστο Το ρεύμα απο έναν μεμονωμένο δίαυλο δεν είναι συνεχόμενο αλλά παρουσιάζει μεταπτώσεις Το ρεύμα που διαπερνά εναν μεμονωμένο δίαυλο ονομάζεται μικροσκοπικό ρεύμα ή μοναδιαίο τυχαίες μεταπτώσεις απο μηδενικό ρεύμα σε μέγιστο Οταν ο δίαυλος ανοίγει το μοναδιαίο ρεύμα παίρνει τη μέγιστή τιμή στιγμιαία και παραμένει σταθερό καθόλη τη διάρκεια του ανοίγματος. Αυτό δίνει στην καταραφή ορθογώνιο σχήμα Τα παραπάνω δείχνουν οτι ο δίαυλος μπορεί να βρίσκεται σε (τουλάχιστον) δύο καταστάσεις : κλειστή ή ανοιχτή

Οι δύο παραπάνω καταστάσεις του διαύλου αναλογούν σε αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωση Η μετάπτωση μεταξύ των κατάστασεων του ιονικού δίαυλου ως μία χημική αντίδραση: C O C: closed -κλειστή O: open -ανοιχτή

Η πιθανότητα ανοίγματος ενος διαύλου είναι δυναμική Ενας δίαυλος μπορεί να ανοίγει και να κλείνει ανεξάρτητα αν υπάρχει ερέθισμα ή όχι. π.χ. η διαφορά δυναμικού για τασεοευαίσθητους διαύλους ή ο νευροδιαβιβαστής για τους συνδεματικούς. Η πιθανότητα ανοίγματος αυξάνεται με την ύπαρξη κατάλληλου ερεθίσματος και μειώνεται σημαντικά κατα την έλλειψη ερεθίσματος.

Μικροσκοπικό ρεύμα Μακροσκοπικό ρεύμα ρεύμα από έναν μεμονωμένο δίαυλο ρεύμα από πολλούς διαύλους συγχρόνως (το άθροισμα) τεχνικές: outside-out patch clamp κυρίως, αλλά επίσης inside out και cell attached. τεχνικές: κυρίως whole cell patch clamp επίσης outside-out patch clamp, inside out και cell attached άν στη μεμβράνη υπάρχουν περισσότεροι

Το μακροσκοπικό ρεύμα δεν έχει ορθογώνιο σχήμα: Διότι δεν ανοίγουν όλοι οι δίαυλοι συγχρόνως (πχ η πιθανότητα ενας δίαυλος να βρίσκεται στην ανοιχτή κατάσταση εξαρτάται από το δυναμικό και το χρόνο). Ανάλογα, δέν απενεροποιούνται όλοι οι δίαυλοι συγχρόνως. Αντίθετα αποτελείται απο μία αύξουσα φάση, κατα την έναρξη του ερεθίσματος, και μια σταθερή ή φθίνουσα φάση κατα την διάρκεια.

Το άθροισμα μεμονομένων ρευμάτων δίνει μακροσκοπικό ρεύμα Υποδοχείς GABAA Το μέγεθος του μικροσκοπικού ρεύματος (για συγκεκριμένο δυναμικό της μεμβράνης) είναι σταθερό, εξαρτάται απο την αγωγιμότητα του. Το μέγεθος του μακροσκοπικού ρεύματος εξαρτάται απο τον αριθμό των ανοιχτών διαύλων ανα πάσα χρονική στιγμή και είναι αναλόγο της πιθανότητας του διαύλου να είναι ανοιχτός.

Δίαυλοι απο διαφορετικά γονίδια διαφέρουν στα χαρακτηριστικά τους Σύκριση δύο διαύλων νατρίου εκπόλωση της μεμβράνης δίαυλος σκελετικού μύ Nav1.4 δίαυλος εγκεφάλου Nav1.1 Μπορούν να διαφέρουν: στην ευαισθησία στην τάση στον αριθμό ανοιγμάτων-κλεισιμάτων στις διάρκειες ανοιγμάτων κλεισιμάτων στην αγωγιμότητα για το ιόν τους Επίσης κάποια χαρακτηριστικά των διαύλων μπορούν να μεταβληθούν με την αλληλεπίδραση του με άλλες πρωτεϊνες. πχ βοηθητικές υπομονάδες, ένζυμα, φωσφορυλίωση κλπ.

Χαρακτηριστικά διαύλων νατρίου

Η απενεργοποίηση του διαύλου Na+ σκελετικός μύς εγκέφαλος -30 mv -70 Μετά απο σύντομο άνοιγμα-κλείσιμο, ο δίαυλος παραμένει κλειστός παρόλο που η μεμβράνη είναι ακόμη επολωμένη. Ο δίαυλος βρίσκεται στη κατάσταση απενεργοποίησης (Inactivation)

Μεταβατικές καταστάσεις του δίαυλου C O I μειωμένη πιθανότητα ανοίγματος , παρόλο που υπάρχει κατάλληλο ερέθισμα Υπερπόλωση της μεμβράνης ευνοεί τη μετάβαση I C Εκπόλωση της ευνοεί τη μετάβαση Ο  Ι άρα, η απενεργοποίηση είναι ευαίσθητη στη τάση

Ο βρόγχος IFM συμμετέχει στην απενεργοποίηση του δίαυλου Ο βρόγχος IFM – ένας ενδοκυτταρικός σύνδεσμος μεταξύ των δομών III και IV Περίεχει το μοτίβο IFM = ισολευκίνη-φαινυλαλανίνη-μεθειονίνη Το μοτίβο IFM είναι υδρόφοβο και δέν είναι φορτισμένο

Πειραματικά δεδομένα: Ο βρόγχος IFM συμμετέχει στην απενεργοποίηση του δίαυλου Πειραματικά δεδομένα: Μετάλλαξη της φαινυλαλανίνης προκαλεί αργοπορία της απενεργοποίησης κατά 5000 φορές. Η απενεγοποίηση μειώνεται με: Έγχυση ενδοπεπτιδασών ενδοκυτταρικά. Έγχυση ενδοκυτταρικά αντισωμάτων ενάντια στο βρόγχο. Αποκοπή του βρόγχου (γενετικά).  υποδεικνύει οτι το IFM συμμετέχει στην απενεργοποίηση Έγχυση συνθετικών πεπτιδίων που περιέχουν το μοτίβο IFM προκαλούν απενεργοποίηση.  Αυτό υποδεικνύει ότι το μοτίβο IFM φράσει τόν δίαυλο.

Η λειτουργία της απενεργοποίησης Κατα το δυναμικό ενέργειας η εκπόλωση της μεμβράνης προκαλεί το άνοιγμα διαύλων νατρίου οι οποίοι με τη σειρά τους εκπολώνουν παραιτέρω τη μεμβράνη (θετική ανάδραση) Χωρίς την απενεργοποίηση αυτό θα είχε σαν αποτέλεσμα τη συνεχόμενη εκπόλωση της μεμβράνης. Η απενεργοποίηση μειώνει τη διάρκεια του δυναμικού ενέργειας . Επιτρέπει στους διαύλους καλίου να επαναπολώσουν τη μεμβράνη. Η απενεργοποίηση του δίαυλου συμβάλλει στην περίοδο ανερεθιστότητας μετά το δυναμικό ενέργειας

Η σχέση της ενεργοποίησης και απενεργοποίησης Η σχέση της ενεργοποίησης και απενεργοποίησης για το μακροσκοπικό ρεύμα νατρίου πρωτόκολλα διέγερσης για την ενεργοποίηση : απο το δυναμικό ηρεμίας, εκπόλωση για την απενεργοποίηση: αρχίζουμε απο διάφορά δυναμικά εκπόλωση στο δυναμικό που έχουμε το μέγιστο άνοιγμα διαύλων Η απενεργοποίηση όπως και η ενεργοποίηση εξαρτάται απο το δυναμικό Ανάλογα με τη διακύμανση του δυναμικού ηρεμίας, η σχέση της απενεργοποίησης με την ενεργοποίηση έχει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία δυναμικού ενέργειας στο δυναμικό ηρεμίας για ένα συγκεκριμένο παρασκεύασμα κάποιοι δίαυλοι είναι ήδη απενεργοποιημένοι. Για τη δημιουργία δυναμικού ενέργιας μορούν να συμμετάσχουν δίαυλοι που δεν είναι απενεργοποιημένοι (βρίσκονται στη κατάσταση C)

Σχέση ρεύματος-δυναμικού δίαυλων Na+ Μικροσκοπικό ρεύμα Μακροσκοπικό ρεύμα Η σχέση δέν είναι ίδια για το μικροσκοπικό και το μακροσκοπικό Το μικροσκοπικό εξαρτάται μόνο από το νόμο του Ohm Το μακροσκοπικό (κατασκευάζεται απο την κορυφή της έντασης του ρεύματος) εξαρτάται απο την πιθανότητα ανοίγματος του δίαυλου, ενεργοποίηση και απενεργοποίηση

Χαρακτηριστικά διαύλων ασβεστίου

Οι τύποι των δίαυλων διαύλων ασβεστίου HVA High voltage activated Ενεργοποίηση με υψηλή τάση Δίαυλοι L, N, P/Q, και R LVA Low voltage activated Ενεργοποίηση με χαμηλή τάση Δίαυλοι T

Καταγραφές απο μεμονομένoυς δίαυλους Ca2+

Δίαυλοι ασβεστίου τύπου Ν Απενεργοποίηση μετά απο εκπόλωση Μοναδιαίο ρεύμα μικρότερο από τα L Δεν χρειάζονται φωσφορυλίωση για την λειτουργία τους (αντίθετα απο τους L) μακροσοπικό ρεύμα απο τους διαύλους Ν, ενδεικτική η απενεργοποίηση Σχέση ρεύματος-τάσης μεμονωμένων δίαυλων τύπου Ν

Ό μηχανισμός απενεργοποίησης διαύλων ασβεστίου Πειραματικά στοιχεία: Η απενεργοποίηση είναι ανάλογη του μεγέθους του ρεύματος Έγχυση ιόντων ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα προκαλλεί απενεργοποίηση Έγχυση ενδοκυτταρικά χηλικών ενώσεων που δεσμέυουν το ασβέστιο (EGTA) μειώνουν το βαθμό απενεργοποίησης εκπόλωση στο δυναμικό ισορροπίας του ασβεστίου (οπότε το ρεύμα είναι 0) δεν προκαλεί απενεργοποίιηση Αποτελεί μηχανισμό αρνητικής ανάδρασης Η ενδοκυττάρια συγκέντρωση ασβεστίου συμβάλλει στην απενεργοποίηση των δίαυλων Ca2+

Δίαυλοι ασβεστίου τύπου L [Ca2+]o= 1 mM [Ca2+]i=0.0001 mM Σχέση ρεύματος-τάσης μεμονωμένων δίαυλων ECa = +116 mV μακροσοπικό ρεύμα απο τους διαύλους L, ενδεικτική η πολύ αργή απενεργοποίηση

Απώλεια της δράσης των δίαυλων L σε απομονωμένη μεμβράνη αλλα όχι των διαύλων Ν απομόνωση τμήματος μεμβράνης με την τεχνική Outside-οut patch clamp ενα λεπτό μετά την απομόνωση παρατηρούνται διαύλοι L και διαύλοι N (τα ρεύματα απο τους Ν εχουν μικρότερο μέγεθος, γιατί;) . * αστεράκι = καταγραφή με άνοιγμα συγχρόνως απο L και Ν πέντε λεπτά μετά την απομόνωση στο ίδιο τμήμα της μεμβράνης παρατηρούνται μόνο δίαυλοι Ν

Οι δίαυλοι L δεν χάνουν τη δραστηριότητα τους σε cell-attached patch clamp καταγραφές Κατα την cell-attached καταγραφή το μέρος του διαύλου που βρίσκεται στο εσωτερικό του κυττάρου παραμένει στο φυσικό του περιβάλλον (κάτι που δεν συμβαίνει σε outside-out καταγραφή) Συμπεραίνουμε ότι υπάρχει κάτι στο κυτταρόπλασμα που είναι αναγκαίο για τη λειτουργία των δίαυλων L

Οι διαύλοι L χρειάζονται φωσφορυλίωση για να λειτουργήσουν Διατήρηση της δραστηριότητας των δίαυλοι L με τη χορήγηση πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA) στην εσωτερική πλευρά της μεβράνης Πλευρά που βρίσκεται στο εσωτερικό του κυττάρου PKA Καταγραφές patch-clamp σε διαμόρφωση Inside-out Η PKA φωσφορυλιώνει τους διαύλους L Συμπέρασμα: Οι διαύλοι L χρειάζονται φωσφορυλίωση για να λειτουργήσουν

Ένα κύτταρο μπορεί να εκφράζει διαύλους Ca2+ N και L Πως θα διαχωρίσουμε τα μακροσκοπικά ρεύματα κάθε τύπου; Εκπόλωση της μεμβράνης απο τα -80 mV στα +20 mV περιέχει N και L δίαλους (a) Για την απομόνωση μακροσκοπικού ρεύματος των δίαυλων L απο τους N, χρησιμοποιούμε τα ηλεκτοφυσιολογικά χαρακτηριστικά τους. Αφου τα Ν απενεργοποιούνται γρήγορα με εκπόλωση (π.χ. στα 0 mV), κρατάμε την μεμβράνη σε επολωμένο δυναμικό (0 mV) και την εκπολώνουμε στα +20 mV οπότε καταγράφουμε μόνο το ρεύμα δίαυλων L (b) Για την απομόνωση των Ν αφαιρούμε την καταγραφή L (b) απο την αρχική N+L (a) (αλλος τρόπος είναι φαρμακολογικά)

Χαρακτηριστικά διαύλων καλίου

Δίαυλοι καλίου delayed rectifier (Κ+DR) Ενεργοποίηση με εκπόλωση Ρεύμα εκροής Κ+ (θετικό) Ενεργοποίηση σε τιμές τάσης θετικότερες του -30 mV δεν απενεργοποιέιται Καμπύλη σχέσης ρεύματος-τάσης αργεί να φτάσει την υψηλότερη τιμή του Σχέση δυναμικού ισορροπίας και εξωκυτταρικής συγκέντρωσης του Κ+

Καταγραφές μεμονομένων δίαυλων Κ+DR Εκπόλωση: Ρεύμα εκροής Κ+ (θετικό) Άνοιγμα δίαυλου με μικρές διακοπές καθόλη τη διάρκεια της εκπόλωσης (ο δίαυλος δεν απενεργοποιείται για δευτερόλεπτα)

Αργοπορία ανοίγματος του δίαυλου Κ+DR μετά την εκπόλωση Η σχέση I-V μεμονωμένων δίαυλων είναι ευθύγραμμη Μοντέλο καταστάσεων διατάξης διαύλου Κ+ C  C’  O Δυο κλειστές καταστάσεις για να εξηγηθει η αργοπορεία στο άνοιγμα Η αργοπορία επιτρέπει το άνοιγμα δίαυλων Να+ και την εκπόλωση της μεμβράνης πριν την επαναπόλωση κατά το δυναμικό ενέργειας

Δίαυλοι καλίου BK και SK Καταγραφές μικροσκοπικών ρευμάτων BK: Big K Μεγάλη τιμή αγωγιμότητας 100-250 pS SK: Small K Μικρή τιμή αγωγιμότητας 10-80 pS Εκπόλωση στα +40 mV

Οι δίαυλοι BK και SK αίναι ευαίσθητοι στην ενδοκυττάρια συγκέντρωση ασβεστίου

Οι δίαυλοι BK Ευαίσθητοι και στη τάση και στο ενδοκυτταρικό ασβέστιο Ευαίσθητοι και στη τάση και στο ενδοκυτταρικό ασβέστιο Η ευαισθησία στην τάση και στο ασβέστιο σχετίζονται: π.χ. η ευαισθησία στο Ca2+ αυξάνεται με εκπόλωση Τεραμερή δομή (4 α) KCa1.1 - α υπομονάδα (S0-S6 διαμεβρανικές δομές, S4 φορτία + αισθητήρας τάσης, βρόγχος P). gονίδιο KCNMA1 Βοηθητικές β υπομονάδες Στο –COOH άκρο της πρωτεϊνης υπάρχουν δομές για δημιουργία μιας τετραμερούς δομής για την αλληλεπίδραση με το ασβέστιο

Τρισδιάστατο διάγραμμα σχέσης της ευαισθησίας στη τάση και το ασβέστιο στους δίαυλους BK

Μονέτλο μεταβατικών καταστάσεων δίαυλων BK

Η πρωτεϊνη καλμοδουλίνη (CaM) λειτουργεί ως υπομονάδα των διαύλων Οι δίαυλοι SK δίαυλοι καλίου με 6 διαμεμβρανικές δομές Ανοίγουν με την αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης ασβεστίου Η πρωτεϊνη καλμοδουλίνη (CaM) λειτουργεί ως υπομονάδα των διαύλων α υπομονάδα γονίδιο KCa2.1 KCNN1 KCa2.2 KCNN2 KCa2.3 KCNN3 KCa3.1 KCNN4

Ο ρόλος των διαύλων SK στο δυναμικό ενέργειας Συμετέχει στη δημιουργία της αργής μετα-υπερπόλωσης (after-hyperpolarization , AHP), αμέσως μετά το δυναμικό ενέργειας. Ερώτηση: τι θα γίνει με τους διαύλους νατρίου οταν η μεμβράνη υπερπολωθεί; Επίσης, ρόλος στον τόνο του λείου μυός, στη διεγερσιμότητα νευρικών κυττάρων