Διαδικασία απομόνωσης γενωμικού DNA από βιολογικό υλικό

Φιαλίδιο με 40 μl πρωτεινάση Κ Φιαλίδιο με 100 μl ισοπροπανόλη A. Απομόνωση DNA Σας δίνεται: Φιαλίδιο με 1,5 ml κενά. Φιαλίδιο με 40 μl πρωτεινάση Κ Φιαλίδιο με 100 μl ισοπροπανόλη Φιαλίδιο με 500 μl IRB (Inhibitor Removal Buffer, Ρυθμιστικό διάλυμα απομάκρυνσης αναστολέων*) Φιαλίδιο με 200 μl ΒΒ (Βinding Buffer, Ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης) Στήλη με φιαλίδιο 2 ml Φιαλίδιο με 500 μl BW (Washing buffer – ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης) Φιαλίδιο με 500 μl BW Φιαλίδιο με 200 μl BE (Elution Buffer – ρυθμιστικό διάλυμα έκλυσης)   Διαδικασία: Έχετε ένα φιαλίδιο με 1,5 ml κενό. Εκεί βάζετε 200 μl ολικού αίματος/ γάλα/ το ρύγχος του στειλεού/ μικρή ποσότητα από τα κόπρανα τεμαχισμένα. Σε αυτό βάζετε 25μl από το φιαλίδιο «Κ» (πρωτεινάση Κ), 200 μl ΒΒ (απορρυπαντικό) αναδεύετε και επωάζετε στους 70οC για 5 min. Προσθέστε 200 μl από το φιαλίδιο «Ι» (ισοσπροπανόλη) και βάλτε όλο το διάλυμα σε μία από τις στήλες (συνοδεύονται από φιαλίδιο των 2 ml) που σας δίνονται. Φυγοκεντρήστε για 1min στις 8.000 rpm και βάλτε την στήλη σε καθαρό φιαλίδιο. Προσθέστε 500 μl IRB, φυγοκεντρήστε όπως πριν και βάλτε την στήλη σε καθαρό φιαλίδιο. Προσθέστε 500 μl BW (wash buffer – διάλυμα πλύσης), φυγοκεντρήστε όπως πριν και βάλτε την στήλη σε καθαρό φιαλίδιο. Επανέλαβε με 500 μl B5, φυγοκεντρήστε όπως πριν και βάλτε την στήλη σε καθαρό φιαλίδιο. Βάλε στη στήλη 200 μl ΒΕ (elution buffer – διάλυμα διάλυσης) θερμοκρασίας 70οC, επώασε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 min και φυγοκέντρησε όπως πριν. Κρατάς το φιαλίδιο και βάζεις τον κωδικό σου. Καθάρισε τον πάγκο σου και βάλε το δείγμα στην κατάψυξη. * Εννοεί, αναστολέων της αντίδρασης PCR

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

Γιατί το κάνουμε Γενετικές αναλύσεις κάθε είδους (έλεγχο γενετικής προδιάθεσης, καθορισμό φύλλου, έλεγχο πατρότητας κτλ) Μικροβιολογικές αναλύσεις πχ ανίχνευση και ταυτοποίηση μικροβιακών παθογόνων

Για να πραγματοποιηθούν αυτές οι εξετάσεις χρειάζεται να Διασπάσουμε την κυτταρική και την πυρηνική (για τα ευκαρυωτικά κύτταρα) μεμβράνη Να απομακρύνουμε πρωτεΐνες και άλλα κυτταρικά υπολείμματα και να Συλλέξουμε το DNA σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα

Κυτταρική λύση Χρησιμοποιούμε το διάλυμα λύσης που περιέχει απορρυπαντικό το οποίο διασπά την κυτταρική και την πυρηνική μεμβράνη καταστρέφοντας το κύτταρο και απελευθερώνοντας το DNA Το DNA συνεχίζει να είναι συνδεδεμένο με πρωτεΐνες που ονομάζονται ιστόνες. Αυτές τις διασπάμε με την πρωτεϊνάση Κ. Η δράση αυτού του ενζύμου καθιστά αναγκαία τη χρήση υδατόλουτρου (προσοχή στην αποδιάταξη)

Στη συνέχεια προσθέτουμε στο διάλυμα μικρή ποσότητα από συμπυκνωμένο διάλυμα άλατος Το διάλυμα αυτό προκαλεί τη συσσωμάτωση των κυτταρικών υπολειμμάτων και των πρωτεϊνών Αυτές καθιζάνουν με φυγοκέντρηση Στο υπερκείμενο παραμένει το DNA Όσο πιο καθαρό είναι το διάλυμα DNA τόσο μικρότερη η πιθανότητα να περιέχει ουσίες που πιθανώς θα αναστείλουν την PCR (αναστολείς)

Προσθέτουμε ισοπροπανόλη (ή αιθανόλη) και αναμιγνύουμε Το DNA δεν διαλύεται στην αλκοόλη και μπορούμε τώρα να το δούμε να αιωρείται στο φιαλίδιο (άρα γιατί βάζουμε την αλκοόλη;) Μετά από φυγοκέντρηση αφαιρούμε το υπερκείμενο Το ίζημα (DNA) διατηρείται στην κατάψυξη για χρόνια

Ερωτήσεις αξιολόγησης Η παρουσία αναστολέων στο διάλυμα DNA προκαλεί ψευδώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα; Στο δείγμα που θα πάρω από ένα ζώο για ανίχνευση ενός παθογόνου μπορώ όταν θα κάνω απομόνωση DNA α επιλέξω να απομονώσω μόνο το DNA του μικροβίου ή θα πάρω αναγκαστικά και το DNA του ξενιστή; Τα πολύ μολυσμένα υλικά (κόπρανα) παράγουν DNA ίδιας ποιότητας με αυτά που είναι σχετικά καθαρά (αίμα); Οι αλλαγές της θερμοκρασίας συντήρησης μπορεί να επηρεάσουν την ποιότητα του DNA που περιέχει ένα δείγμα;