Διαδικασία ηλεκτροφόρησης DNA με σκοπό τη διαπίστωση της παρουσίας DNA του βακτηρίου Brucella σε κλινικά δείγματα που αναλύθηκαν με PCR

Για ποιο λόγο χρειαζόμαστε την ηελκτροφόρηση; Το αποτέλεσμα της PCR είναι ένα φιαλίδιο που περιέχει διάφορα μόρια δίκλωνου DNA Εμείς γνωρίζουμε ότι αν το δείγμα που πήραμε από το ζώο και αναλύσαμε με PCR περιείχε και το βακτήριο Brucella εκτός από το DNA του ξενιστή, τότε θα πρέπει μέσα στο φιαλίδιο της PCR να υπάρχει το ειδικό για το συγκεκριμένο βακτήριο προϊόν ενίσχυσης DNA Το προϊόν αυτό γνωρίζω ότι είναι μεγέθους περίπου 240 ζεύγη βάσεων Πώς θα αναλύσει το DNA του φιαλιδίου ώστε να διακρίνω βάσει μεγέθους τα μόρια DNA που περιέχει; Αν βρω τρόπο να κάνω αυτή την ανάλυση,πώς θα βρω αν το μόριο DNA που έχει ενισχυθεί με το PCR είναι ακριβώς στο μέγεθος που πρέπει; Μπορεί το μέγεθος DNA να μην είναι ακριβώς αυτό που αναμένεται; Τι σημαίνει αυτό ;

Η ιδέα της ηλεκτροφόρησης βασίζεται … Το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο Αν το βάλω σε ένα μέσο στα άκρα του οποίου εφαρμόσω ηλεκτρική τάση, τότε το DNA θα μετακινηθεί προς τον θετικό πόλο Επειδή το ρεύμα είναι δεδομένο ως προς την ισχύ και τη διάρκειά του, μόρια DNA μικρότερου μεγέθους (μ.β.) θα διανύσουν μεγαλύτερη απόσταση

Το μέγεθος του τεμαχίου DNA το …προσδιορίζουμε κατ’εκτίμηση συγκρίνοντάς το με τα τεμάχια DNA στα οποία αναλύεται ο “δείκτης μοριακών βαρών» (DNA ladder) Ο τελευταίος κατασκευάζεται ώστε να είναι γνωστή η σύνθεσή του, και διατίθεται εμπορικά

Όμως πώς καταφέρνουμε να “δούμε” το DNA; Για να το καταστήσουμε ορατό προσθέτουμε στο διάλυμα της πηκτής αγαρόζης όσο αυτή είναι σε υγρή κατάσταση, μία χημική ουσία που ονομάζεται βρομιούχο αιθίδιο Την πηκτή αγαρόζης τοποθετούμε σε πηγή παραγωγής υπεριώδους φωτός για να δούμε το φθορίζον φως

Το βρομιούχο αιθίδιο συνδέεται στο DNA και ειδικότερα μεταξύ των 2 αλυσίδων του (άρα το μονόκλωνο DNA δεν καθίσταται ορατό)

Το βρ. αιθ. έχει την ιδιότητα να παράγει φθορίζον φως (χρώματος πορτοκαλί) η ένταση του οποίου εικοσαπλασιάζεται όταν αυτή η ουσία συνδεθεί με το DNA Το βρ. αιθ. σε μεγάλη δόση θεωρείται καρκινογόνο, μεταλλαξιογόνο και τερατογόνο

Διαδικασία ηλεκτροφόρησης http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

Δ. Προετοιμασία πηκτής αγαρόζης για ηλεκτροφόρηση του DNA Ετοιμάστε διάλυμα 30ml, 2% w:v, αγαρόζης σε ΤΑΕ (Tris Acetic Acid EDTA) Τοποθετήστε το σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι να διαλυθεί (περίπου 2 min) Αφήστε το διάλυμα να κρυώσει Τοποθετήστε 3μl βρωμιούχο αιθίδιο (προσοχή τοξικό) Τοποθετήστε το τελικό διάλυμα στην ειδική συσκευή πήξης της αγαρόζης μέχρι να στερεοποιηθεί Ε. Προετοιμασία του προϊόντος DNA για ηλεκτροφόρηση 1. Προσθέστε στο φιαλίδια (1 δείγμα, 1 C+, 1C- = 3 δείγματα) της αντίδρασης PCR 3 ml (διάλυμα φόρτωσης) loading buffer 2. Το προϊόν τοποθετείται στην ειδική υποδοχή της πηκτής αγαρόζης 3. Συνδέστε την ηλεκτρική πηγή και ηλεκτροφορείστε για 30 λεπτά στα 100V. ΣΤ. Έλεγχος αποτελέσματος Τοποθετήστε την πηκτή αγαρόζης στη συσκευή υπεριώδους φωτός Ελέγξετε το αποτέλεσμα

Ερωτήσεις αυτό-αξιολόγησης Τι είναι η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και πού χρησιμοποιείται; Με ποιο τρόπο καθίσταται το DNA ορατό; Μπορούμε να δούμε το δίκλωνο και το μονόκλωνο DNA και γιατί; Ποιο τεμάχιο DNA θα διανύσει μεγαλύτερη απόσταση κατά την ηλεκτροφόρησή του, ένα που θα είναι μεγέθους 400 ζευγών βάσεων ή αυτό που είναι 600 ζευγών βάσεων ; Τι χρησιμοποιούμε για να βρούμε το μέγεθος του κάθε τεμαχίου;