Ωρίμανση του πρωτογενούς προϊόντος της μεταγραφής Συρραφή Εξωνίων-Εναλλακτική συρραφή εξωνίων-Μεταγράφωμα ΜΔΕ: Εφαρμογές της βιολογίας στην ιατρική Μάθημα :Μοριακή Βιολογία Υπεύθυνος Καθηγητής :Γεώργιος Κ. Ροδάκης Επιμέλεια: Ευτυχία Λάμπρου

ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΠΡΟΔΡΟΜΟΥ ΜΟΡΙΟΥ RNA (RNA processing) α. Τροποποίηση των άκρων i. Τροποποίηση του 5΄ άκρου. Κάλυψη του 5΄ άκρου (capping) ii. Τροποποίηση του 3΄ άκρου. Προσθήκη αλληλουχίας poly(Α) μετά την τομή στη θέση πολυαδενυλίωσης (ΑΑUΑΑ) β. Εκτομή των εσωνίων και σύνδεση των εξωνίων (ασυνεχή γονίδια)

 Συρραφή του προδρόμου μορίου RNA (RNA splicing) α. Θέσεις τομής στα όρια εξωνίου – εσωνίου « Κανόνας GU-AG » GU στο 5΄ άκρο του εσωνίου AG στο 3΄ άκρο του εσωνίου Συντηρημένες αλληλουχίες β. Θέση διακλάδωσης (branch site) Εξαιρέσεις: 5΄ΑU….AC 3΄ 5΄και 3΄ Θέσεις Τομής ( 5΄ and 3΄ splice sites) Γειτονικές θέσεις των GU-AG Mol.biol.of the cell, fourth edition

 Αντίδραση της συρραφής εξωνίων  2 trans-εστεροποιήσεις όπου μια -ΟΗ προσβάλλει έναν φωσφοδιεστερικό δεσμό  5΄-2΄ δεσμός ανάμεσα στο 5΄άκρο και μια Α στη θέση διακλάδωσης - Δομή θηλιάς (lariat) Genes viii

 Μηχανισμός της συρραφής εξωνίων Συμμετοχή μικρών πυρηνικών RNA (small nuclear RNA): snRNA snRNA : U1,U2,U4,U5,U6 snRNA + πρωτεΐνες ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα snRNPs snRNPs + πρωτεΐνες : spliceosome spliceosome : σωμάτιο ή συσκευή συρραφής του pre-mRNA U1 U2AF,BBP U2 U4/U6 U5:U4/U6/U5 U6/U2 U5 U6/U2/U5 snRNPΝέος κύκλος αντιδράσεων

 Self-splicing 3 κατηγορίες ιντρονίων α. των πρόδρομων πυρηνικών mRNA β. ιντρόνια ομάδας Ι γ.ιντρόνια ομάδας ΙΙ Το pre-mRNA εκτελεί μόνο του την αποκοπή εσωνίων, χωρίς χρήση ενζύμων ! Mol.biol.of the cell, fourth edition Προέλευση των πυρηνικών ιντρονίων από ιντρόνια ομάδας ΙΙ Τα snRNA απάλλαξαν το pre- mRNA από την «υποχρέωση» να φέρει τις απαιτούμενες αλληλουχίες

 Trans-splicing Genes viii Πραγματοποιείται με το SL-RNA Πιθανό βήμα στην εξέλιξη της συσκευής συρραφής των pre-mRNA

 Εναλλακτική συρραφή εξωνίων-alternative splicing Το αρχικό μετάγραφο2 ή περισσότερα mRNA που κωδικοποιούν 2 ή περισσότερες πρωτεΐνες ή μετάγραφα που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες (non-protein-coding RNAs) Πώς επιτυγχάνεται? Πολλαπλά πρότυπα συρραφής Διαφορετικές επιλογές μεταξύ θέσεων συρραφής Σκοπός  Γονιδιακή ρύθμιση  Πρωτεϊνική ποικιλομορφία

 Τύποι εναλλακτικής συρραφής εξωνίων  Αποκοπή κάποιου εξωνίου (exon skipping ή exon cassette mode)  Εναλλακτικές 3΄ θέσεις τομής (alternative acceptor site)  Eναλλακτικές 5΄θέσεις τομής (alternative donor site)  Διατήρηση εσωνίου ( intron retention) Biassays 30:38-47,2008

 Καθορισμός του φύλου στη Drosophila Αποκοπή Εξωνίου (Exon skipping) Εναλλακτική 3΄θέση συρραφής(alternative 3’ splice site) Αρνητικός έλεγχος από Sxl Αποκοπή εξωνίου στο αρσενικό Θετικός έλεγχος της Tra στο θηλυκό κ΄ Mol.biol.of the cell, fourth edition

Εναλλακτική 5΄θέση τομής (Alternative 5΄ splice site) Αμοιβαία αποκλεισμένα εξώνια (Mutually exclusive alternative exons) SV 40 ιός T αντιγόνο t αντιγόνο Η 5΄θέση ματίσματος που χρησιμοποιείται για το Τ αφαιρεί ένα κωδικόνιο τερματισμού που υπάρχει στο mRNA του t Genes viii Mol.biol.of the cell, fourth edition α-τροπομυοσίνη Λείος μυς Εξώνιο 2 Σκελετικός μυς κ΄ μη μυικά κύτταρα Εξώνιο 3

 Διατήρηση εσωνίου (intron retention) RNA – ωριμάση και κυτόχρωμα b στη ζύμη εξώνιο1εξωνιο2 εξώνιο3 pre-mRNA εξώνιο1εξωνιο2 εξώνιο3 mRNA ωριμάσης εξώνιο3 εξώνιο1εξωνιο2 mRNA κυτοχρώματος b  H «σπατάλη» του γενετικού υλικού για την παρουσία εσωνίων καταλήγει σε «οικονομία»  Πιο συχνά συναντάται στους κατώτερους ευκαρυωτικούς  Στα σπονδυλόζωα πιθανό να αντιπροσωπεύει ελλειπή τρόπο συρραφής

 DSCAM γονίδιο στη Drosophila Mol.biol.of the cell, fourth edition  Το τελικό mRNA έχει 24 εξώνια και 4 από αυτά αντιπροσωπεύουν «συστοιχίες» από εναλλακτικά εξώνια διαφορετικές πρωτείνες ! ! !  Στον άνθρωπο ~ 60% των προδρόμων μορίων RNA υπόκεινται σε εναλλακτική συρραφή εξωνίων Χαρακτηριστικά γονίδια στον άνθρωπο που υφίστανται εναλλακτική συρραφή εξωνίων Ανοσοσφαιρίνες Νευροξίνες Ν-καδερίνες Κανάλια Ca+

 Ρύθμιση της εναλλακτικής συρραφής εξωνίων  Ρυθμιστικές αλληλουχίες κοντά στις θέσεις συρραφής  Επηρεάζουν τη συγκρότηση του σωματίου συρραφής κ΄ το πρότυπο συρραφής  Ενισχυτές της συρραφής(splicing enhancers) ή καταστολείς της συρραφής (splicing silencers)  Αποτελούν θέσεις πρόσδεσης πρωτεϊνών

Alternative splicing and disease,Review,2008 SR πρωτείνες Πλούσιες σε αργινίνη-σερίνη Ενεργοποιούνται με φωσφορυλίωση Ενισχυτικό ρόλο hnRNP Κατασταλτικό ρόλο  2γης δομή του RNA κοντά στις θέσεις συρραφής  snoRNA (small nucleolar RNA),BII-52 Προσδένεται σε ένα εξώνιο εναλλακτικό του υποδοχέα της σεροτονίνης Δεν εκφράζεται σε άτομα με σύνδρομο Prader Willi

 Aσθένειες και συρραφή m-RNA Μεταλλάξεις σε ρυθμιστικές αλληλουχίες του pre-mRNA  Αποκλεισμός εξωνίων από το mRNA  Ενεργοποίηση απόκρυφων θέσεων τομής (cryptic sites) Μεταλλάξεις σε ογκοκατασταλτικά γονίδια Alternative splicing and disease,Review,2008

 Νon-protein-coding-RNAs Μετάγραφα συρραφής εξωνίων που δεν παράγουν πρωτείνη Στον άνθρωπο 97-98% ΔΕΝ μεταφράζονται Πρόδρομο RNA που δεν επιδέχεται ωρίμανση RNAs μετά από ωρίμανση και εναλλακτική ωρίμανση  Αυτά τα μετάγραφα μπορεί να είναι… Εναλλακτική ωρίμανση  Ορισμένα miRNAsΜετάγραφο στον C.elegans Mετάγραφο Bic στο ποντίκι  snoRNAsΠιθανόν ορισμένα προέρχονται από εναλλακτική συρραφή εξωνίων κ στη συνέχεια ρυθμίζουν την εναλλακτική συρραφή του RNΑ

Συμπέρασμα…. Πολλά ερωτηματικά για την μετα μεταγραφική ωρίμανση του RNA ??? Ειδικά για το….. alternative splicing και τον ρόλο των Non-protein-coding RNAs που προκύπτουν από αυτό

Βιβλιογραφία Molecular Biology of the cell. Alberts,Johnson,Lewis,Raff,Roberts,Walter. Fourth edition Genes VIII. B. Lewin(2004).Ελληνική έκδοση Ειδικά κεφάλαια μοριακής βιολογίας. Γ. Ροδάκης,Σ. Τσιτήλου,Ρ.Λεκανίδου, Αθήνα 2002 Επιστημονικά άρθρα Alternative splicing and disease. Jamal Tazia, Nadia Bakkoura and Stefan Stammb,a b Βιβλία Biochimica et Biophysica Acta 1972 (2009) Challenging the dogma: the hidden layer of non-protein-coding RNAs in complex organisms. Mattick J.S.Bioessays, 2003 Oct;25(10):930-9 Protein diversity from alternative splicing: a challenge for bioinformatics and post-genome biology.Black DL. Cell 2000 Oct 27;103(3): Alternative splicing: new insights from global analyses.Blencowe BJ. Cell 2006 Jul 14;126(1): Alternative splicing current perspectives. Kim E, Goren A, Ast G.Bioessays Jan;30(1): Review. Function of alternative splicing.Stefan Stamm et al.Gene 344 (2005) 1-20.Review Strategies for Identifying RNA Splicing Regulatory Motifs and Predicting Alternative Splicing Events. Dirk Holste *, Uwe Ohler * PLoS Comput Biol 4(1): e21. doi: /journal.pcbi *