08-Ευκαρυωτική μεταγραφή-IΙ

Παρουσίαση με θέμα: "08-Ευκαρυωτική μεταγραφή-IΙ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 08-Ευκαρυωτική μεταγραφή-IΙ

2 Η RNA pol I έχει διμερή υποκινητή

3 rRNA locus Ζύμη: 150 Μύγα: 240 Βάτραχος: 600 Άνθρωπος: 350
Arabidopsis: 570 Μπιζέλι: 3900 Καλαμπόκι: 12000

4

5 Christmas tree replication

6 H δομή του υποκινητή rRNA
Οι υποκινητές των διαφόρων οργανισμών εμφανίζουν παρόμοια δομή αλλά μικρή ομοιότητα αλληλουχίας Ο κεντρικός υποκινητής είναι πλούσιος σε ΑΤ, αλλά μόνο το rInr είναι σχετικά συντηρημένο ανάμεσα στους διάφορους οργανισμούς

7 Οι μεταγραφικές μονάδες της RNA πολυμεράσης Ι έχουν έναν κεντρικό υποκινητή ο οποίος διαχωρίζεται με ~70 bp από το ανοδικό στοιχείο του υποκινητή. Η πρόσδεση του UBF στο UPE διεγείρει τη σύνδεση του παράγοντα πρόσδεσης (TIF1A, SLI/TIF-IB) στον κεντρικό υποκινητή. Αυτός ο παράγοντας τοποθετεί την RNA pol Ι στο σημείο έναρξης. Ο ΠΠΚΥ έχει την κύρια ευθύνη για τη σωστή τοποθέτηση της RNA pol I στο σημείο έναρξης Η απόσταση ανάμεσα σε ΠΠΚΥ και UBF μπορεί να μεταβληθεί κατά ακέραιο αριθμό στροφών DNA

8 Η επιμήκυνση της RNA pol I
Ο ρυθμός επιμήκυνσης της ανθρώπινης RNA pol I είναι ~95 νουκλεοτίδια το sec (~2-4) του ρυθμού της RNA pol II) Κατά την επιμήκυνση, η RNA pol I αποδεσμεύεται από τους UBF και SL1/TIF-1B Η πολυμεράση αποδεσμεύεται όταν φτάσει στην αλληλουχία τερματισμού Η ελεύθερη πολυμεράση μπορεί να ξαναρχίσει μια νέα μεταγραφή από έναν ήδη ενεργοποιημένο υποκινητή (όπου ήδη έχουν προσδεθεί οι UBF και SL1/TIF-1B) Η συνεχής παρουσία των UBF και SL1/TIF-1B εξασφαλίζει τη γρήγορη έναρξη κάθε κύκλου

9 Ο τερματισμός της RNA pol I
O TTF-1 (transcription termination factor-1) προσδένεται στο πλαίσιο Sal Η πολυμεράση Ι σταματά όταν συναντήσει τον TTF-1 O PTRF (polymerase transcription release factor) αλληλεπιδρά με πολυμεράση και TTF-1, αποδεσμεύοντας την πολυμεράση

10 Το προϊόν της μεταγραφής της pol I είναι ένα μεγάλο πρόδρομο rRNA.
Το μόριο αυτό υφίσταται εκτεταμένη επεξεργασία. Ο τερματισμός συμβαίνει σε απόσταση ~1000 βάσεων καθοδικά του 3' άκρου του ώριμου rRNA. Ο τερματισμός προϋποθέτει την αναγνώριση αλληλουχίας τερματισμού 18 βάσεων από βοηθητικό παράγοντα.

11 Τα ώριμα ευκαρυωτικά rRNA δημιουργούνται από ένα πρωτογενές μετάγραφο με φαινόμενα αποκοπής και περιορισμού των άκρων.

12 Η RNA pol III H RNA pol III χρησιμοποιεί καθοδικούς και ανοδικούς υποκινητές

13 Οι υποκινητές των 5S και tRNA είναι καθοδικοί.
Οι υποκινητές των snRNA είναι ανοδικοί.

14 έναρξη 10bp Μεταγραφή 2 kb 10bp Μεταγραφή 2 kb έναρξη

15 Η ανάλυση με ελλείμματα δείχνει ότι ο υποκινητής των γονιδίων 5S RNA είναι εσωτερικός: η έναρξη λαμβάνει χώρα σε καθορισμένη απόσταση (~55 bp) ανοδικά του υποκινητή.

16 Οι υποκινητές της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ μπορεί να αποτελούνται από διμερή στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά του σημείου έναρξης, οπότε ένα πλαίσιο Α συνδυάζεται είτε με ένα πλαίσιο C είτε με ένα πλαίσιο B. Εναλλακτικά, μπορεί να αποτελούνται από διακριτά στοιχεία ανοδικά του σημείου έναρξης (Oct, PSE, TATA).

17 Στους εσωτερικούς υποκινητές pol III τύπου 2, η πρόσδεση του παράγοντα TFΙΙΙC στις αλληλουχίες των πλαισίων Α και B είναι προϋπόθεση για τη σύνδεση του παράγοντα τοποθέτησης TFΙΙΙB, ο οποίος στρατολογεί την RNA πολυμεράση ΙΙΙ.

18 Στους εσωτερικούς υποκινητές pol III τύπου 1, οι παράγοντες συναρμολόγησης TFΙΙΙA και TFΙΙΙC προσδένονται αντίστοιχα στα πλαίσια Α και C, προκειμένου να προσελκύσουν τον παράγοντα τοποθέτησης TFΙΙΙB, o οποίος στρατολογεί την RNA πολυμεράση ΙΙΙ.

19 Η αντίδραση τερματισμού της pol III (5S rRNA, tRNAs, small RNAs) μοιάζει με αυτή των προκαρυωτών.
Ο τερματισμός συμβαίνει συνήθως στη 2η U σε σειρά 4 U σε περιοχή πλούσια σε GC.

20 Σύνθεση και επεξεργασία ευκαρυωτικού RNA

21 Το ευκαρυωτικό mRNA τροποποιείται κατά τη διάρκεια ή μετά το πέρας της μεταγραφής του

22 Το ευκαρυωτικό mRNA τροποποιείται με την προσθήκη μιας καλύπτρας στο 5΄ άκρο και μιας ουράς πολυ (Α) στο 3΄ άκρο.

23 Επισκόπηση: Η έκφραση του mRNA σε ζωικά κύτταρα απαιτεί μεταγραφή, τροποποίηση, επεξεργασία, πυρηνο-κυτταροπλασματική μεταφορά και μετάφραση.

24 Η μεταγραφή στα ζωικά κύτταρα συμβαίνει με την ίδια περίπου ταχύτητα που συμβαίνει και στα βακτήρια (~40 b / sec). Για ένα γονίδιο 10,000 bp χρειάζονται ~5 λεπτά για να μεταγραφεί.

25

26 Η καλύπτρα ασφαλίζει το 5΄ άκρο του mRNA και μπορεί να μεθυλιωθεί σε αρκετές θέσεις.

27 Η καλύπτρα 0 υπάρχει σε όλους τους ευκαρυώτες
Η καλύπτρα 0 υπάρχει σε όλους τους ευκαρυώτες. Στους μονοκύτταρους ευκαρυώτες υπάρχει μόνο αυτή (το υπεύθυνο ένζυμο είναι η 7-μεθυλο-τρανσφεράση της γουανίνης). Η καλύπτρα 1 είναι ο κύριος τύπος καλύπτρας εκτός από τους μονοκύτταρους. Η καλύπτρα 2 αντιπροσωπεύει λιγότερα από το % του συνολικού πληθυσμού του mRNA που είναι καλυμμένο. Οι ποσοστιαίες αναλογίες των διαφόρων τύπων καλύπτρας είναι χαρακτηριστικές για ένα συγκεκριμένο οργανισμό.

28 Το 3’ άκρο πολυαδενυλιώνεται
CPSF: cleavage and polyadenylation specificity factor CstF: cleavage stimulation factor rich

29 Η οργάνωση του γονιδίου της β-σφαιρίνης του ανθρώπου

30 Το μάτισμα και η επεξεργασία του RNA

31 Ασυνεχή γονίδια απαντώνται σε όλες τις τάξεις των οργανισμών:
Ασυνεχή γονίδια απαντώνται σε όλες τις τάξεις των οργανισμών: Μικρό ποσοστό σε κατώτερους ευκαρυώτες Πλειοψηφία στους ανώτερους ευκαρυώτες Τυπικό γονίδιο θηλαστικού: 7-8 εξόνια σε έκταση ~16kb. Εξόνια: ~ bp, ιντρόνια: >1kb.

32

33 Το μάτισμα εμπλέκεται στην παραγωγή μεγαλύτερου ποσοστού (50%) mRNA από το αναμενόμενο βάσει της ανάλυσης του γονιδιώματος. Το πυρηνικό RNA (hnRNA) έχει μέσο μέγεθος κατά πολύ μεγαλύτερο του mRNA, είναι ασταθές και η αλληλουχία του εμφανίζει μεγαλύτερη πολυπλοκότητα.

34 Το hnRNA απαντάται ως ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο με μορφή μιας σειράς από χάντρες.
Περίπου 20 πρωτεΐνες συμμετέχουν στη δημιουργία του hnRNA. Οι πρωτεΐνες αυτές τυπικά υπάρχουν σε ~108 αντίγραφα ανά πυρήνα, συγκρινόμενες με τα ~106 μόρια του hnRNA. Κάποιες μπορεί να έχουν δομικό ρόλο στο πακετάρισμα. Άλλες παλινδρομούν μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος συμμετέχοντας στην εξαγωγή του RNA από τον πυρήνα.

35 Το RNA τροποποιείται στον πυρήνα με προσθήκες στα 5΄ και 3΄ άκρα και με μάτισμα, ώστε να αφαιρεθούν τα ιντρόνια. Η διαδικασία του ματίσματος απαιτεί τη διάσπαση των θέσεων συνένωσης εξονίου-ιντρονίου και τη συρραφή των άκρων των εξονίων. Το ώριμο mRNA μεταφέρεται μέσα από τους πυρηνικούς πόρους στο κυτταρόπλασμα, όπου μεταφράζεται.

36 Πειραματική απόδειξη ότι το γονίδιο της ωοαλβουμίνης της κότας είναι διακοπτόμενο

37 Εξέταση της δομής του γονιδίου της ωοαλβουμίνης με ηλεκτρονική μικροσκοπία υβριδίων DNA-mRNA.

38 Το μέγεθος ο αριθμός των ιντρονίων κυμαίνεται σε μεγάλο εύρος

39 Στη ζύμη, τα περισσότερα γονίδια δεν είναι διακοπτόμενα
Στη ζύμη, τα περισσότερα γονίδια δεν είναι διακοπτόμενα. Αντίθετα, στις μύγες και στα θηλαστικά, τα περισσότερα γονίδια είναι διακοπτόμενα. Τα μη διακοπτόμενα γονίδια έχουν μόνο ένα εξόνιο και το ποσοστό τους σε κάθε οργανισμό αντιστοιχεί στο ύψος της κόκκινης ράβδου.

40 Τα γονίδια της ζύμης είναι μικρά, ενώ στις μύγες και στα θηλαστικά το μέγεθός τους ποικίλλει και μπορεί να έχουν πολύ μεγάλο μήκος.

41 Τα εξόνια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες συνήθως είναι μικρά

42 Το μήκος των ιντρονίων μπορεί να κυμαίνεται από πολύ μικρό έως πολύ μεγάλο.

43 Ο μηχανισμός του ματίσματος

44 Οι θέσεις ματίσματος είναι βραχείες αλληλουχίες
Τα σημεία συνένωσης διαθέτουν καλά συντηρημένες, αν και μικρές σε μήκος, πρότυπες αλληλουχίες.

45 Τα άκρα των πυρηνικών ιντρονίων καθορίζονται, ως επί το πλείστον, από τον κανόνα GU-AG.
Οι δύο θέσεις ματίσματος έχουν διαφορετική αλληλουχία και έτσι προσδιορίζουν τη φορά του ιντρονίου. Σημειακές μεταλλάξεις στις θέσεις ματίσματος (GT-AG) παρεμποδίζουν το μάτισμα είτε in vivo είτε in vitro, αποδεικνύοντας ότι οι συντηρημένες αλληλουχίες είναι πράγματι αυτές που αναγνωρίζονται κατά το μάτισμα.

46 Οι θέσεις ματίσματος διαβάζονται κατά ζεύγη
Μόνο οι σωστοί συνδυασμοί θέσεων ματίσματος αναγνωρίζονται ανά ζεύγη.

47 Όλες οι 5' θέσεις ματίσματος είναι λειτουργικά ισοδύναμες και όλες οι 3' θέσεις είναι επίσης λειτουργικά ισοδύναμες. Παρόλα αυτά, το μάτισμα πραγματοποιείται μεταξύ των 5' και 3' θέσεων του ίδιου ιντρονίου.

48 Με ποια σειρά αφαιρούνται τα ιντρόνια από ένα μόριο RNA;

49 Στύπωμα τύπου Northern πυρηνικού RNA χρησιμοποιώντας το γονίδιο μιας ωοβλεννοειδούς πρωτεΐνης ως ιχνηθέτη δείχνει διακριτά ενδιάμεσα μόρια κατά το μάτισμα. Αναγράφονται τα συστατικά τμήματα των κυρίαρχων ζωνών. Εάν τα ιντρόνια αφαιρούνταν με τυχαία σειρά θα υπήρχαν περισσότερα από 300 πρόδρομα μόρια. Εν τούτοις, δεν υπάρχει ένα μοναδικό μονοπάτι, καθώς ανιχνεύονται ενδιάμεσα μόρια από τα οποία έχουν αφαιρεθεί διαφορετικοί συνδυασμοί ιντρονίων.

50 Splicing in outline

51 Η θέση διακλάδωσης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση της 3' θέσης ματίσματος.
Στο ζυμομύκητα είναι συντηρημένη. Ελλείμματα στη θέση διακλάδωσης αποτρέπει το μάτισμα. Στους ανώτερους ευκαρυώτες είναι λιγότερο συντηρημένη  σε περίπτωση ελλείμματος χρησιμοποιούνται κρυφές θέσεις, που όμως βρίσκονται στη γειτονιά.  Ο ρόλος της θέσης διακλάδωσης είναι να αναγνωρίζει την πλησιέστερη 3' θέση ματίσματος.

52 Οι ρόλοι των snRNPs και των συνδεόμενων πρωτεϊνών κατά το μάτισμα

53 Το εναλλακτικό μάτισμα

54 Από ένα pre-mRNA είναι δυνατόν να παραχθούν δύο ή περισσότερα mRNA
>95% των γονιδίων του ανθρώπου υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα Ιδιοστατικά εξόνια (κόκκινο) Προαιρετικά εξόνια (μπλε- πράσινο) Εναλλακτικές θέσεις ματίσματος

55 1. To εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου WT1
Ορισμένες μεταλλαγμένες μορφές του γονιδίου WT1 προκαλούν τον όγκο Wilms: παιδικό νεφροβλάστωμα WT1 έχει μήκος ~50 kb Κωδικοποιεί μέχρι και 24 πρωτεϊνικές ισομορφές kDa μέσω εναλλακτικού ματίσματος: Τρία εναλλακτικά κωδικόνια έναρξης Εναλλακτικό μάτισμα της εξονικής κασέτας 5 Εναλλακτικών θέσεων ματίσματος στο εξόνιο 9 Άλλες μετα-μεταγραφικές τροποιποιήσεις

56 2. Το εναλλακτικό μάτισμα του Dscam
Η δροσόφιλα έχει ~ νευρώνες. Κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, θα πρέπει να υπάρχει ένα σύστημα που, με απόλυτη ακρίβεια και επαναληψιμότητα, να καθοδηγεί τους νευράξονες που αναπτύσσονται στον προορισμό τους, ώστε να δημιουργηθούν τα διάφορα νευρωνικά συστήματα. Στις μύγες φαίνεται ότι το γονίδιο Dscam αναλαμβάνει μέρος αυτής της διαδικασίας

57 Ο ρόλος του DSCAM στη δημιουργία του αμφιβληστροειδούς των σπονδυλωτών
The vertebrate retina and DSCAM in self-avoidance. (A) The vertebrate retina is organized in columnar microcircuits connecting rod and cone photoreceptors in the outer nuclear layer (ONL) to horizontal (purple), bipolar (orange), and amacrine (blue) interneurons in the inner nuclear layer (INL) by synapses formed in the outer plexiform layer (OPL). The interneurons in turn form synapses in the inner plexiform layer (IPL) onto the dendrites of ganglion cells in the retinal ganglion cell layer (RGL), which project axons to the brain through the optic nerve. Establishing this anatomy involves both vertical organization into the different layers, and horizontal organization in which cells of a given type are non-randomly spaced and their dendritic arbors process information uniformly in circumferential space. (B) The circumferential spacing in a wild type retina is depicted for two cell types, in which the cell bodies of each cell type are non-randomly spaced from other cells of the same type, but are randomly distributed in relation to the cell bodies of other cell types. In addition, the dendritic arbors of these cells overlap, even within single cell types. This spacing is referred to as a mosaic. (C) In the absence of DSCAM, the dendrites and cell bodies of the neurons fasciculate and clump in a cell-type-specific manner, representing a loss of self-avoidance at the level of both individual cells and between cells of a given subtype. (A adapted from Garrett and Burgess, 2011.)

58 Επιλέγοντας μία παραλλαγή εξονίου 4, 6, 9 και 17 κάθε φορά, ο συνολικός αριθμός των πιθανών ισομορφών εναλλακτικά ματισμένου mRNA είναι 1248332=38016 Αυτό αντιστοιχεί σε 2-3 φορές του συνολικού αριθμού των γονιδίων της Drosophila!

59 Αφού όλες οι παραλλαγές των εξονίων 4, 6, 9 και 17 έχουν τα ίδια 5’ και 3’ σημεία ματίσματος, είναι άγνωστος: Ο μηχανισμός επιλογής της κάθε παραλλαγής Ο λόγος για τον οποίο δεν χρησιμοποιούνται και διπλανές παραλλαγές στο ίδιο μετάγραφο

60 3. Το μονοπάτι φυλοκαθορισμού στη Drosophila

61 Η διαφορική ενεργοποίηση του γονιδίου sxl σε θηλυκά και αρσενικά

62

63

64 Exonic Splicing Enhancer: Ενισχυτής ματίσματος για την παρακείμενη 3' θέση

65 Dsx alternative splicing in males and females
Pre-mRNAs from the D. melanogaster gene dsx contain 6 exons. In males, exons 1,2,3,5,and 6 are joined to form the mRNA, which encodes a transcriptional regulatory protein required for male development. The exon 4 is eliminated. In females, Tra1 and Tra2 in splicing between 3 and 4 th exons, thus exons 1,2,3, and 4 are joined, and a polyadenylation signal in exon 4 causes cleavage of the mRNA at that point. The resulting mRNA is a transcriptional regulatory protein required for female development. This is an example of exon skipping alternative splicing. The intron upstream from exon 4 has a weak-consensus polypyrimidine tract, to which U2AF proteins bind poorly without assistance from splicing activators. This 3' splice acceptor site is therefore not used in males. Females, however, produce the splicing activator Transformer (Tra). The SR protein Tra2 is produced in both sexes and binds to an ESE in exon 4; if Tra is present, it binds to Tra2 and, along with another SR protein, forms a complex that assists U2AF proteins in binding to the weak polypyrimidine tract. U2 is recruited to the associated branch point, and this leads to inclusion of exon 4 in the mRNA. The Dsx protein in female prevents male sex organ differentiation and development and the Dsx protein in females blocks male sex organ development.

66 Λεπτομέρειες των βημάτων ρύθμισης του φυλοκαθορισμού στη Drosophila

67 Τι να μελετήσετε Tropp (μέχρι σελ. 751)