1 Αρχές εργαστηριακού ελέγχου της υγιεινής

ΚΤ & Χ ΚΤ ΤΙΠΟΤΑ 2

3 Η δομή του ζωικού κυττάρου Ευκαρυωτικό με πυρήνα και οργανίλια Ευκαρυωτικό με πυρήνα και οργανίλια Δεν φέρουν κυτταρικό τοίχωμα (;) αντίθετα από τα άλλα 2 είδη ευκαρυωτικών κυττάρων (μυκήτων και φυτών) Δεν φέρουν κυτταρικό τοίχωμα (;) αντίθετα από τα άλλα 2 είδη ευκαρυωτικών κυττάρων (μυκήτων και φυτών) 3

4 Τα βακτηριακά κύτταρα Δεν έχουν πυρήνα Δεν έχουν πυρήνα Τα οργανίλιά τους βρίσκονται διασκορπισμένα στο κυτταρόπλασμα Τα οργανίλιά τους βρίσκονται διασκορπισμένα στο κυτταρόπλασμα

5 Το γενετικό τους υλικό αποτελείται συνήθως από 1 ή 2 μόρια κυκλικού DNA που συνιστούν χρωμοσώματα και είναι υπεύθυνα για την αναπαραγωγή Το γενετικό τους υλικό αποτελείται συνήθως από 1 ή 2 μόρια κυκλικού DNA που συνιστούν χρωμοσώματα και είναι υπεύθυνα για την αναπαραγωγή Υπάρχουν συχνά και πλασμίδια (= κυκλικά μόρια εξω - χρ ω μοσωμικού DNA) Υπάρχουν συχνά και πλασμίδια (= κυκλικά μόρια εξω - χρ ω μοσωμικού DNA)

Ιοί (ορισμός): Υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα με μέγεθος 0,025 – 0,25 μm. Ιοί (ορισμός): Υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα με μέγεθος 0,025 – 0,25 μm. Οι ιοί μπορεί να προσβάλουν και βακτήρια (φάγοι) Οι ιοί μπορεί να προσβάλουν και βακτήρια (φάγοι) 6

Ανάπτυξη σε συνθετικά θρεπ. υλικά Πολλαπλασιασμός με διχοτόμηση Περιέχουν DNA και RNA Ικανότητα πρωτεϊνο- σύνθεσης Ευαισθησία σε αντιβιοτικά ΒακτήριαΣυνήθως ναιΝαι ΙοίποτέόχιDNA ή RNAόχι 7

8 Βασικοί ορισμοί Γονίδιο: Η βασική δομική και λειτουργική μονάδα της κληρονομικότητας. Μόνο το 10% του γενώματος αντιστοιχεί σε γονίδια Γονίδιο: Η βασική δομική και λειτουργική μονάδα της κληρονομικότητας. Μόνο το 10% του γενώματος αντιστοιχεί σε γονίδια Χρωμόσωμα: αποτελείται από πρωτεΐνες και DNA Χρωμόσωμα: αποτελείται από πρωτεΐνες και DNA Χαρτογράφηση: ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Χαρτογράφηση: ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

9 Άμεση διαγνωστική δοκιμή (αντιγονική εξέταση): Άμεση διαγνωστική δοκιμή (αντιγονική εξέταση): –διαγνωστική δοκιμή που αποσκοπεί στην ανάδειξη της παρουσίας του μικροβίου σε ένα κλινικό υλικό ή κάποιου αντιγόνου του Έμμεση διαγνωστική δοκιμή: αποσκοπεί στην ανίχνευση της παρουσίας σε ένα κλινικό υλικό κάποιου προϊόντος που υποδηλώνει την παρουσία του μικροβίου χωρίς όμως να την αποδεικνύει Έμμεση διαγνωστική δοκιμή: αποσκοπεί στην ανίχνευση της παρουσίας σε ένα κλινικό υλικό κάποιου προϊόντος που υποδηλώνει την παρουσία του μικροβίου χωρίς όμως να την αποδεικνύει

10 Αντιγονικές διαγνωστικές εξετάσεις Μικροσκοπική εξέταση 1.Πώς αυξάνουμε τη διακριτική της ικανότητα; 2.Πού βασίζεται η διάγνωση; –Πλεονεκτήματα: Απλή, χαμηλό κόστος, θετική προγνωστική αξία, υψηλή θετική προγνωστική αξία ιδίως σε περιπτώσεις in-situ ανίχνευσης –Μειονεκτήματα: Διάγνωση (;), ελάχιστο όριο ανίχνευσης, εμπειρία ιδίως σε μικτούς πληθυσμούς, μη-ορατά βακτήρια, ευαισθησία

11 Απομόνωση σε καλλιέργεια –Πώς ταυτοποιούμε το προϊόν; –Εκλεκτικά / εμπλουτιστικά θρεπτικά υλικά –Πλεονεκτήματα: ανάδειξη βιωσιμότητας, υλικό για περαιτέρω εξετάσεις, αρχειοθέτηση για επιδημιολογικούς σκοπούς, αντιβιόγραμμα, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία –Μειονεκτήματα: ελάχιστο όριο ανίχνευσης, πώς ξεχωρίζεις το παθογόνο από έναν μικτό πληθυσμό, απομόνωση βακτηρίων με βραδεία ανάπτυξη από μικτούς πληθυσμούς, ευαισθησία

Έμμεση διαγνωστική δοκιμή Πχ η ανίχνευση αντισωμάτων με ELISA, CFT κτλ Πχ η ανίχνευση αντισωμάτων με ELISA, CFT κτλ Πλεονέκτημα Πλεονέκτημα –Εφαρμόζονται συνήθως σε ορό αίματος (και για αυτό λέγονται ορολογικές) που μπορεί να ληφθεί εύκολα –Δεν χρειάζεται να ξέρω πολλά για την παθογένεια του νοσήματος για να αποφασίσω τι είδους δείγμα θα πάρω –Αν υπάρχουν αντισώματα θα τα βρω 12

Μειονεκτήματα (1) Η ύπαρξη αντισωμάτων δεν σημαίνει ότι έχω το νόσημα (χαμηλή θετική προγνωστική αξία) Η ύπαρξη αντισωμάτων δεν σημαίνει ότι έχω το νόσημα (χαμηλή θετική προγνωστική αξία) Αυτά μπορεί να υπάρχουν επειδή Αυτά μπορεί να υπάρχουν επειδή –Εμβολιάστηκα –Έχω εκτεθεί σε μικρή αντιγονική πρόκληση που δεν θα προκαλέσει ποτέ νόσημα (ενδημικά νοσήματα) –Διασταυρωμένες αντιδράσεις (ψευδώς θετικά) 13

Μειονεκτήματα (2) Η έλλειψη αντισωμάτων δεν σημαίνει οπωσδήποτε ότι δεν έχω το νόσημα π.χ. Η έλλειψη αντισωμάτων δεν σημαίνει οπωσδήποτε ότι δεν έχω το νόσημα π.χ. –Άτομα με ανοσοκαταστολή –Νεφροπαθείς με πρωτεϊνουρία –Κακή διατροφή ή γενετική προδιάθεση Γενικά πάντως η έλλειψη αντισωμάτων στην πράξη τείνει να εκλαμβάνεται ορθώς ως αποτέλεσμα μη έκθεσης στο μικρόβιο 14

15 Μοριακές εξετάσεις PCR, ReT-PCR, RT-PCR PCR, ReT-PCR, RT-PCR Τι είναι και τι κάνουν… Τι είναι και τι κάνουν…

16 PCR – Polymerase Chain Reaction

17 PCR – Polymerase Chain Reaction In-vitro ενζυμική σύνθεση και ενίσχυση επιλεγμένων τμημάτων DNA με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδίων εκκινητών In-vitro ενζυμική σύνθεση και ενίσχυση επιλεγμένων τμημάτων DNA με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδίων εκκινητών 17

18

19

20 Brucella melitensis biovar Abortus ABC transporter (mglA) pseudogene, partial sequence Brucella melitensis biovar Abortus ABC transporter (mglA) pseudogene, partial sequence LOCUS DQ bp DNA linear BCT 22-AUG-2006 LOCUS DQ bp DNA linear BCT 22-AUG-2006 DEFINITION Brucella melitensis biovar Abortus ABC transporter (mglA) DEFINITION Brucella melitensis biovar Abortus ABC transporter (mglA) pseudogene, partial sequence. pseudogene, partial sequence. ACCESSION DQ ACCESSION DQ VERSION DQ GI: VERSION DQ GI: REFERENCE 1 (bases 1 to 844) REFERENCE 1 (bases 1 to 844) AUTHORS Jacob,J. and Mielke,M.E.A. AUTHORS Jacob,J. and Mielke,M.E.A. TITLE Genetic diversity at mglA locus in Brucella abortus S19 small TITLE Genetic diversity at mglA locus in Brucella abortus S19 small versus large colony variants versus large colony variants JOURNAL Submitted (07-JUL-2006) FG 14, Robert Koch-Institute, Nordufer 20, JOURNAL Submitted (07-JUL-2006) FG 14, Robert Koch-Institute, Nordufer 20, Berlin, FRG 13353, Germany Berlin, FRG 13353, Germany –1 atgcggcata tcctgctata tgccagagaa agtgagatca tgtcccaaga tcacaaagcc 61 gccgcgacat catcgcagcc ggtgctgcgt cttagcggta tatccaagaa tttcggcgct 61 gccgcgacat catcgcagcc ggtgctgcgt cttagcggta tatccaagaa tttcggcgct 121 gtttcggcac tgaccgatat cgatctggaa gtctttcccg gcgaagtcgt cgcccttgtc 121 gtttcggcac tgaccgatat cgatctggaa gtctttcccg gcgaagtcgt cgcccttgtc 181 ggcgataacg gcgcgggaaa gtccaccctt gtcaaaacgc ttgctggtgt gcaccagccc 181 ggcgataacg gcgcgggaaa gtccaccctt gtcaaaacgc ttgctggtgt gcaccagccc 241 acttccggca ccatcgagtt caatggtgag aaggtcgtac tttcttcgcc cggcgttgcg 241 acttccggca ccatcgagtt caatggtgag aaggtcgtac tttcttcgcc cggcgttgcg 301 cttgatcttg gtatcgcgac ggtttttcag gatttgagtc gctctgcgag aacctcgatg 301 cttgatcttg gtatcgcgac ggtttttcag gatttgagtc gctctgcgag aacctcgatg 361 tcgtcgccaa tatttttctg ggccgcgaga taagccctta ccgtctcgat gaagtgtcaa 361 tcgtcgccaa tatttttctg ggccgcgaga taagccctta ccgtctcgat gaagtgtcaa 421 tggaaatcaa ggcgtggaag cttctcaatg aattatccgc ccgcattccc agtgtgcgcg 421 tggaaatcaa ggcgtggaag cttctcaatg aattatccgc ccgcattccc agtgtgcgcg 481 agccggtagc ctcgctctcc ggcggccaac gccagacggt cgcgatttcc cgttcgctgc 481 agccggtagc ctcgctctcc ggcggccaac gccagacggt cgcgatttcc cgttcgctgc 541 ttctcgatcc gaagctcatc atgctggacg aaccgactgc cgcccttggt gtcgcgcaga 541 ttctcgatcc gaagctcatc atgctggacg aaccgactgc cgcccttggt gtcgcgcaga 601 ctgcggaagt gctggatctt atcgagcgcg tgcgcgaccg tggccttggc gtcatcatga 601 ctgcggaagt gctggatctt atcgagcgcg tgcgcgaccg tggccttggc gtcatcatga 661 ttagccataa catggaagat gtgcgtgctg cggcttgggt gcaataacgg cattttctat 661 ttagccataa catggaagat gtgcgtgctg cggcttgggt gcaataacgg cattttctat 721 cctgattcat caaatgagga actggttgcc gccattaccg gggctaccag caattctgtt 721 cctgattcat caaatgagga actggttgcc gccattaccg gggctaccag caattctgtt 781 tcgcgccgtg ccgaaagacg gctggcgcag cacgataatg cgcatggccg gggggaagtc 781 tcgcgccgtg ccgaaagacg gctggcgcag cacgataatg cgcatggccg gggggaagtc 841 cgat 841 cgat // //

21 Specialized BLAST Choose a type of specialized search (or database name in parentheses.) Choose a type of specialized search (or database name in parentheses.) Make specific primers with Primer-BLAST Make specific primers with Primer-BLASTPrimer-BLAST Search trace archives Search trace archivestrace archivestrace archives Find conserved domains in your sequence (cds) Find conserved domains in your sequence (cds)conserved domainsconserved domains Find sequences with similar conserved domain architecture (cdart) Find sequences with similar conserved domain architecture (cdart)conserved domain architectureconserved domain architecture Search sequences that have gene expression profiles (GEO) Search sequences that have gene expression profiles (GEO)gene expression profilesgene expression profiles Search immunoglobulins (IgBLAST) Search immunoglobulins (IgBLAST)immunoglobulins Search for SNPs (snp) Search for SNPs (snp)SNPs Screen sequence for vector contamination (vecscreen) Screen sequence for vector contamination (vecscreen)vector contaminationvector contamination Align two (or more) sequences using BLAST (bl2seq) Align two (or more) sequences using BLAST (bl2seq) Align Search protein or nucleotide targets in PubChem BioAssay Search protein or nucleotide targets in PubChem BioAssayproteinnucleotideproteinnucleotide Search SRA transcript libraries Search SRA transcript librariestranscript librariestranscript libraries

22 ReT-PCR, Real Time PCR

23 Μέθοδος in-vitro ενζυμικής ποσοτικοποιημένης ενίσχυσης επιλεγμένων τμημάτων γενετικού υλικού Μέθοδος in-vitro ενζυμικής ποσοτικοποιημένης ενίσχυσης επιλεγμένων τμημάτων γενετικού υλικού

24 Πώς γίνεται η ποσοτικοποίηση Πώς γίνεται η ποσοτικοποίηση Πώς υποδηλώνει μικροβιακή ποσότητα Πώς υποδηλώνει μικροβιακή ποσότητα

25 RT-PCR, Reverse Transcription PCR

26 Τεχνική in-vitro ενζυμικής ενίσχυσης επιλεγμένων τμημάτων RNA Τεχνική in-vitro ενζυμικής ενίσχυσης επιλεγμένων τμημάτων RNA Μετατροπή του RNA σε cDNA και ενίσχυση με PCR Μετατροπή του RNA σε cDNA και ενίσχυση με PCR

27 Έλεγχος της παρουσίας ενός βακτηρίου με τρόπο που υποδηλώνει και το εάν είναι ζωντανό ή όχι Έλεγχος της παρουσίας ενός βακτηρίου με τρόπο που υποδηλώνει και το εάν είναι ζωντανό ή όχι Η μόνη μέθοδος για ανίχνευση RNA ιών Η μόνη μέθοδος για ανίχνευση RNA ιών

28 Γενικά χαρακτηριστικά μοριακών εξετάσεων ως διαγνωστικών εφαρμογών –Πλεονεκτήματα: Ελάχιστο όριο ανίχνευσης, ειδικότητα, ευαισθησία, θετική προγνωστική αξία –Μειονεκτήματα: Αρνητική προγνωστική αξία, πολυπλοκότητα, κόστος, δυσχερής κλινική αξιολόγηση, ειδικό εξοπλισμό, επαγρύπνηση για ψευδείς αντιδράσεις

29 Πώς επιλέγουμε τη διαγνωστική προσέγγιση που θα ακολουθήσουμε

30 Για ποιο σκοπό κάνουμε την εξέταση ; A.Εξέταση ρουτίνας Β. Αντιμετώπιση κάποιου προβλήματος υγιεινής

31 A.Εξέταση ρουτίνας Τι χαρακτηριστικά πρέπει να έχουν οι εξετάσεις που θα διαλέξουμε σε αυτή την περίπτωση i.Υψηλή αρνητική προγνωστική αξία ή υψηλή θετική προγνωστική αξία ii.Υψηλή ευαισθησία ή ειδικότητα iii.Κόστος

32 Β. Αντιμετώπιση κάποιου προβλήματος υγιεινής Τι θα πρέπει να συνεκτιμήσουμε: i. Φύση της ασθένειας (αιτιολογία, παθογένεια) ii. Εμβολιασμό iii. Φορείς

33 Τι χαρακτηριστικά πρέπει να έχουν οι εξετάσεις που θα διαλέξουμε για αντιμετώπιση προβλήματος σε επίπεδο εκτροφής; i.Υψηλή αρνητική προγνωστική αξία ή υψηλή θετική προγνωστική αξία ii.Υψηλή ευαισθησία ή ειδικότητα iii.Κόστος

34 Τι χαρακτηριστικά πρέπει να έχουν οι εξετάσεις που θα διαλέξουμε για αντιμετώπιση προβλήματος σε επίπεδο ζώου; i.Υψηλή αρνητική προγνωστική αξία ή υψηλή θετική προγνωστική αξία ii.Υψηλή ευαισθησία ή ειδικότητα iii.Κόστος

35 Συνέχεια… IV. Τι επιβάλει η σχετική νομοθεσία; φυματίωσηβρουκέλωση V. Πώς θα επιτύχουμε την καλύτερη δυνατή σχέση κόστους / αποτελέσματος; Εφαρμογή συνδυασμού μεθόδων ….

36 Εφαρμογή συνδυασμού μεθόδων Ορολογική στο σύνολο των ζώων ή σε κάποια επιλεγμένα (σε ποιά ζώα; Τι γίνεται αν έχουμε εμβολιάσει – χρήση ζεύγους ορών;) και Ορολογική στο σύνολο των ζώων ή σε κάποια επιλεγμένα (σε ποιά ζώα; Τι γίνεται αν έχουμε εμβολιάσει – χρήση ζεύγους ορών;) και Αντιγονική επιλεκτικά σε κάποια άλλα (σε ποια ζώα; Σε τι υλικό; Πώς αξιολογούμε κλινικά το αποτέλεσμα αναλόγως του είδους της εξέτασης – βιωσιμότητα;) Αντιγονική επιλεκτικά σε κάποια άλλα (σε ποια ζώα; Σε τι υλικό; Πώς αξιολογούμε κλινικά το αποτέλεσμα αναλόγως του είδους της εξέτασης – βιωσιμότητα;)

Ερωτήσεις αυτό-αξιολόγησης Τι ονομάζουμε πλασμίδιο Τι ονομάζουμε πλασμίδιο Σε τι διαφέρουν τα βακτήρια από τους ιούς αναφορικά με α) την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε θρεπτικά υλικά, β) τον πολλαπλασιασμό τους, γ) το είδος του γενετικού υλικού που φέρουν, δ) την ικανότητά τους να πρωτεϊνοσυνθέτουν, και ε) την ευαισθησία τους σε αντιβιοτικά Σε τι διαφέρουν τα βακτήρια από τους ιούς αναφορικά με α) την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε θρεπτικά υλικά, β) τον πολλαπλασιασμό τους, γ) το είδος του γενετικού υλικού που φέρουν, δ) την ικανότητά τους να πρωτεϊνοσυνθέτουν, και ε) την ευαισθησία τους σε αντιβιοτικά Δώστε μερικά παραδείγματα άμεσων και έμμεσων διαγνωστικών δοκιμών Δώστε μερικά παραδείγματα άμεσων και έμμεσων διαγνωστικών δοκιμών Ποια είναι τα βασικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της μικροσκοπικής εξέτασης/της καλλιέργειας/της PCR/της ορολογικής εξέτασης, ως μεθόδου διάγνωσης. Ποια είναι τα βασικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της μικροσκοπικής εξέτασης/της καλλιέργειας/της PCR/της ορολογικής εξέτασης, ως μεθόδου διάγνωσης. Τι ονομάζουμε PCR, τι ανιχνεύει αυτή η μέθοδος, μας δίνει θετικό αποτέλεσμα όταν το βακτήριο ή ο ιός που ανιχνεύεται είναι νεκρά; Πώς επηρεάζει αυτό τον τρόπο συντήρησης του δείγματος που προορίζεται για εξέταση με PCR; Τι ονομάζουμε PCR, τι ανιχνεύει αυτή η μέθοδος, μας δίνει θετικό αποτέλεσμα όταν το βακτήριο ή ο ιός που ανιχνεύεται είναι νεκρά; Πώς επηρεάζει αυτό τον τρόπο συντήρησης του δείγματος που προορίζεται για εξέταση με PCR; Ποια πρόσθετη πληροφορία μας παρέχει η PCR αληθούς χρόνου και ποια η RT-PCR; Ποια πρόσθετη πληροφορία μας παρέχει η PCR αληθούς χρόνου και ποια η RT-PCR; 37

Τι χαρακτηριστικά θα πρέπει να έχει μία διαγνωστική μέθοδος που θα επιλέξω για να διαπιστώσω ποια ζώα νοσούν σε ένα κοπάδι στο οποίο έχει εκδηλωθεί κάποιο νόσημα; Τι χαρακτηριστικά θα πρέπει να έχει μία διαγνωστική μέθοδος που θα επιλέξω για να διαπιστώσω ποια ζώα νοσούν σε ένα κοπάδι στο οποίο έχει εκδηλωθεί κάποιο νόσημα; Τι χαρακτηριστικά θα πρέπει να έχει μία διαγνωστική μέθοδος που θα επιλέξω για να κάνω έλεγχο (ρουτίνας) της υγιεινής σε ένα κοπάδι όταν δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμένο πρόβλημα; Τι χαρακτηριστικά θα πρέπει να έχει μία διαγνωστική μέθοδος που θα επιλέξω για να κάνω έλεγχο (ρουτίνας) της υγιεινής σε ένα κοπάδι όταν δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμένο πρόβλημα; Τι ονομάζουμε «ζεύγη ορών» και πώς τα χρησιμοποιούμε; Τι ονομάζουμε «ζεύγη ορών» και πώς τα χρησιμοποιούμε; 38