ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ "ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ" ΙΩΑΝΝΑ ΒΑΡΕΛΑ Μοριακή Βιολογία: Αρχές και Μεθοδολογία ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ DNA RFLP, RAPD, SSCP

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ Η ύπαρξη πολλαπλών αλληλομόρφων ενός γενετικού τόπου ονομάζεται γενετικός πολυμορφισμός. Για να θεωρηθεί ένα αλληλόμορφο πολυμορφικό, θα πρέπει να απαντάται στον πληθυσμό με συχνότητα >1%. Οι πολυμορφισμοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γενετικοί δείκτες (genetic markers). Επίπεδα που δρουν:  Φαινότυπο → επηρεάζουν μια γονιδιακή λειτουργία  Τμήμα περιορισμού → επηρεάζουν μια θέση-στόχο ενός ενζύμου περιορισμού  Αλληλουχία → παρατηρούνται με ταυτοποίηση του DNA

ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ PCR (Polymerase Chain Reaction) Τρία βήματα: 1.Θερμική αποδιάταξη DNA (90-95 ˚C) 2.Πρόσδεση εκκινητών (50-65 ˚C) 3.Επιμήκυνση εκκινητών (72 ˚C)

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Ενδονουκλεάσες περιορισμού Αναγνωρίζουν και κόβουν ειδικές αλληλουχίες του δίκλωνου DNA, μήκους 4-8 νουκλεοτιδίων. Συχνά δημιουργούνται μετά το κόψιμο μονόκλωνες συμπληρω- ματικές ουρές στο DNA.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Εφαρμογές...  Στην χαρτογράφηση του DNA. Οι RFLP μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γενετικοί δείκτες για τον υπολογισμό της συχνότητας ανασυν- δυασμού σε σχέση με ένα φαινοτυπικό δείκτη.

Εφαρμογές...  Στη διάγνωση γενετικών ασθενειών.  Στον προσδιορισμό των ατόμων που βρίσκονται σε ομάδες υψηλού και χαμηλού κινδύνου όσον αφορά στην προδιάθεση για ορισμένες ασθένειες (όπως ο διαβήτης, η στεφανιαία νόσος)

Εφαρμογές...  Στην αποτύπωση DNA (DNA fingerprinting) Έλεγχος πατρότητας Ιατροδικαστική Suspects Αποτύπωση DNA από μια κηλίδα αίματος από τον τόπο του εγκλήματος και από 7 ύποπτους. (Cellmark Diagnostics, Germantown, MD.)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Πλεονεκτήματα  Ανίχνευση πολυμορφισμών χωρίς να απαιτείται να γνωρίζουμε την αλληλουχία που θέλουμε να μελετήσουμε  Γρήγορη και απλή  Φθηνή και δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό  Δεν απαιτεί ραδιοσήμανση  Ιδανική για αποτύπωση DNA  Έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για την ανάλυση ειδών βακτηρίων και φυτών

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Μειονεκτήματα  Δεν ενδείκνυται για έλεγχο πατρότητας και γενεαλογικές αναλύσεις  Οι ομοζυγώτες δε διαχωρίζονται από τους ετεροζυγώτες  Απαιτεί αυστηρή βελτιστοποίηση των συνθηκών

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

Πλεονεκτήματα  Τεχνική ανίχνευσης μεταλλάξεων  Γρήγορη και απλή  Φθηνή και δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό  Δεν απαιτεί ραδιενεργότητα  Μπορεί να ελέγξει πολυμορφισμούς και μεταλλάξεις σε διάφορες θέσεις στο DNA (σε αντίθεση με την RFLP)

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) Μειονεκτήματα  Δεν χαρακτηρίζεται η φύση και η θέση της μετάλλαξης  Πολλοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία της τεχνικής (σταθερότητα ηλεκτροφόρησης, συγκέντρωση πηκτώματoς, αλληλουχία DNA…)  Μπορεί εύκολα να δώσει ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα (ταυτόχρονη χρήση αρνητικών και θετικών δειγμάτων ελέγχου και αυστηρή βελτιστοποίηση)  Δεν μπορεί να γίνει ανάλυση σε τμήματα DNA >400bp (πρέπει πρώτα να γίνει πέψη με ένζυμα περιορισμού)

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms)

ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ  Μινιδορυφορικοί (minisatellite) ή εν σειρά επαναλήψεις μεταβλητού αριθμού (VNTRs Variable Number Tandem Repeats)  Μικροδορυφορικοί (microsatellite) ή μικρές εν σειρά επαναλήψεις (STRs, Short Tandem Repeats) SSLPs (Simple Sequence Length Polymorphisms)

Σχηματική παράσταση που περιγράφει την ανάπτυξη τεχνικών ανάλυσης γενετικών δεικτών και την εξέλιξη τους τις τελευταίες δύο δεκαετίες.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Agarwal Μ, Shrivastava Ν, Padh Η. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep 27: ,  Alberts Β, Johnson Α, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, New York and London,  Atienzar FA, Jha AN. The random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: A critical review. Mutat Res 613:76-102,  Brown, T.A. Genomes. Garland Science, New York and London,  Costabile M, Quach A, Ferrante A. Molecular approaches in the diagnosis of primary immunodeficiency diseases. Hum Mutat 27(12): ,  Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM. Introduction to Genetic Analysis. W. H. Freeman & Co, New York,  Lewin. Genes VII. Ακαδημαϊκές εκδόσεις, Αλεξανδρούπολη,  Newton CR, Graham A. PCR. Introduction to Biotechniques. Βios Scientific Publishers, Oxford,  Strachan T and Read AP. Human Molecular Genetics 2. Garland Science, New York and London,  Λεκανίδου Ρ, Τσιτήλου Σ, Ροδάκης Γ. Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία. Εκδόσεις ΕΚΠΑ, Αθήνα  Σκορίλας Α. Αρχές κλινικής χημείας και μοριακής διαγνωστικής. Εκδόσεις ΕΚΠΑ, Αθήνα, 2007.