Η 17-AAG ΕΠΑΓΕΙ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΗΣ ΟΥΡΟΔΟΧΟΥ ΚΥΣΤΗΣ ΛΟΓΩ ΜΕΙΟΡΥΘΜΙΣΗΣ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ «ΠΕΛΑΤΩΝ» ΤΗΣ Hsp90 ΣΤΟ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ Akt Καρκούλης Π.Κ. 1, Στραβοπόδης Δ.Ι. 2, Κωνσταντάκου Ε.Γ. 2, Μαργαρίτης Λ.Χ. 2 και Βουτσινάς Γ.Ε. 1 1 Εργαστήριο Περιβαλλοντικής Μεταλλαξιγένεσης και Καρκινογένεσης, Ινστιτούτο Βιολογίας, Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος», Πατρ. Γρηγορίου και Νεαπόλεως, Αγ. Παρασκευή 15310, Αθήνα; 2 Τομέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιόπολη, Ζωγράφου 15784, Αθήνα Εισαγωγικά στοιχεία Πρωτεϊνη Θερμικού Σοκ 90 (Hsp90) 1-2% πρωτεϊνικού περιεχομένου του κυτταροπλάσματος Μεσολαβεί στην ωρίμανση και σταθερότητα μια ποικιλίας πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου Αντιβιοτικά Ανσαμυκίνης τύπου Βενζοκινόνης 17-AAG (17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin) Πρόσδεση στην αμινοτελική περιοχή της πρωτεΐνης (ATP binding domain) και κατ’ επέκταση απενεργοποίηση του μορίου

Υλικά και Μέθοδοι Βιολογικό Σύστημα 4,5% των κακοηθειών (6% στους άνδρες και 3% στις γυναίκες). 4,5% των κακοηθειών (6% στους άνδρες και 3% στις γυναίκες). 4 η πιο συχνή μορφή καρκίνου στους άνδρες και 9 η στις γυναίκες. 4 η πιο συχνή μορφή καρκίνου στους άνδρες και 9 η στις γυναίκες θάνατοι ανά έτος (ΗΠΑ) θάνατοι ανά έτος (ΗΠΑ). Καρκίνος της Ουροδόχου Κύστης Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης RT4 Grade I RT112 Grade I  II T24 Grade III Ανάλυση Κυτταρικού Κύκλου  Κυτταρομετρία Ροής-Δοκιμασία FACS Ανάλυση Κυτταρικού Κύκλου  Κυτταρομετρία Ροής-Δοκιμασία FACS Μελέτη Κυτταρικής Βιωσιμότητας  Ανίχνευση Μεταβολικής Μιτοχονδριακής Ενεργότητας  Δοκιμασία ΜΤΤ Μελέτη Κυτταρικής Βιωσιμότητας  Ανίχνευση Μεταβολικής Μιτοχονδριακής Ενεργότητας  Δοκιμασία ΜΤΤ Ανίχνευση Μεταγραφικής Ενεργότητας Μελών του Γονιδιώματος  Απομόνωση ολικού RNA από κυτταρικά εκχυλίσματα  Αντίδραση Αντίστροφης Μεταγραφής  Ημι-ποσοτική Αντίδραση Αλυσιδωτής Πολυμεράσης (Semi-quantitative RT-PCR) Ανίχνευση Μεταγραφικής Ενεργότητας Μελών του Γονιδιώματος  Απομόνωση ολικού RNA από κυτταρικά εκχυλίσματα  Αντίδραση Αντίστροφης Μεταγραφής  Ημι-ποσοτική Αντίδραση Αλυσιδωτής Πολυμεράσης (Semi-quantitative RT-PCR) Ανίχνευση Μελών του Κυτταρικού Πρωτεώματος  Απομόνωση πρωτεϊνών από ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα  Ανάλυση κατά Western (Western blot Analysis) Ανίχνευση Μελών του Κυτταρικού Πρωτεώματος  Απομόνωση πρωτεϊνών από ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα  Ανάλυση κατά Western (Western blot Analysis)

Αποτελέσματα Επίδραση του 17-AAG στον κυτταρικό κύκλο καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης control0.01 μM 17-AAG 0.1 μM 17-AAG 1 μM 17-AAG 10 μM 17-AAG G0-G1: 64.44% G2-M: 9.75% S: 26.02% G0-G1: 69.23% G2-M: 5.04% S: 25.74% G0-G1: 72.65% G2-M: 0.00% S: 27.35% G0-G1: 83.27% G2-M: 0.00% S: 16.73% G0-G1: 71.87% G2-M: 0.62% S: 27.50% Cdk434 kDa AAG μM Cyclin D1 RT4 T bp Επίδραση του 17-AAG στην επιβίωση καρκινικών κυττάρων ουροδόχου κύστης Επίδραση του 17-AAG στο μόριο-στόχο του, την Hsp90 17-AAG μM α-tubulin pan-actin Hsp70 70 kDa 45 kDa 52 kDa Hsp90α/β 90 kDa RT4RT112T kDa

Αποτελέσματα Επίδραση του 17-AAG στο σηματοδοτικό μονοπάτι Akt 17-AAG μM IGF-1Ra Akt FKHR IKKα IKKβ p44/42 85 kDa 87 kDa 44/42 kDa 95 kDa 60 kDa 78/82 kDa 70/68 kDa RT4RT112T24 cIAP1 Survivin RT4 T24 17-AAG μM bp 356 bp 17-AAG και απόπτωση καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης 18 kDa 57 kDa 35 kDa AAG μM Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3 PARP Lamin A/C 47 kDa 37/35 kDa 116 kDa 89 kDa 70/68 kDa 28 kDa 43/41 kDa 19/17 kDa RT4RT112T

Συμπεράσματα-Συζήτηση Η χορήγηση 17-AAG σε καρκινικές κυτταρικές σειρές της ουροδόχου κύστης οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου, μειορυθμίζοντας το σύμπλοκο Cdk4/CyclinD1, γεγονός που επιφέρει G1/S block, Η χορήγηση 17-AAG σε καρκινικές κυτταρικές σειρές της ουροδόχου κύστης οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου, μειορυθμίζοντας το σύμπλοκο Cdk4/CyclinD1, γεγονός που επιφέρει G1/S block, η 17-AAG προκαλεί μείωση της βιωσιμότητας ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης, οδηγώντας στην ανάπτυξη αποπτωτικού φαινοτύπου, η 17-AAG προκαλεί μείωση της βιωσιμότητας ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης, οδηγώντας στην ανάπτυξη αποπτωτικού φαινοτύπου, η χορήγηση 17-AAG προκαλεί απενεργοποίηση και διάσπαση της πρωτεΐνης- μοριακής συνοδού Hsp90, η χορήγηση 17-AAG προκαλεί απενεργοποίηση και διάσπαση της πρωτεΐνης- μοριακής συνοδού Hsp90, η επαγόμενη από 17-AAG απενεργοποίηση της Hsp90 οδηγεί σε μειορύθμιση πρωτεϊνών «πελατών» της, που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι Akt κα τέλος, η επαγόμενη από 17-AAG απενεργοποίηση της Hsp90 οδηγεί σε μειορύθμιση πρωτεϊνών «πελατών» της, που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι Akt κα τέλος, η μειωμένη παρουσία των παραπάνω πρωτεϊνών συνδέεται με αντίστοιχη μείωση των επιπέδων έκφρασης mRNA των μεταγραφικών στόχων του NF-κB, όπως είναι τα γονίδια Survivin και cIAP1. η μειωμένη παρουσία των παραπάνω πρωτεϊνών συνδέεται με αντίστοιχη μείωση των επιπέδων έκφρασης mRNA των μεταγραφικών στόχων του NF-κB, όπως είναι τα γονίδια Survivin και cIAP1.