Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης για το πρόγραμμα του ΕΣΠΑ Εργαστήριο: Μοριακής Βιολογίας Υπέυθυνος: Ρήγας Σταμάτης Ασκούμενοι: Πατριανάκος Στέφανος, AM: Τεμπλαλέξης Δημήτριος, ΑΜ: Διάρκεια: Ιούλιος – Αύγουστος 2014

Πορεία της πρακτικής άσκησης Κατά τη διάρκεια της πρακτικής άσκησης πραγματοποιήθηκαν δύο τεχνικές. Η πρώτη ήταν η απομόνωση του γενωματικού DNA από φυτό Arabidopsis thaliana, το οποίο παρατηρήσαμε σε ένα gel αγαρόζης μετά από ηλεκτροφόρηση. Η δεύτερη ήταν η αλκαλική λύση βακτηρίων, τα οποία είχαμε αναπτύξει σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο, για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA, στο οποίο έγινε και πάλι ηλεκτροφόρηση.

Εξοπλισμός Εργαστήριου Πιπέττες - Φυγόκεντρος

Συσκευή Ηλεκτροφόρησης

Μαγνητικός αναδευτήρας – pHμετρο

Κωνικές φιάλες – Ογκομετρικοί Κύλινδροι

Αυτόκαυστο - Υδατόλουτρο

Μικροσκόπιο - Στερεοσκόπιο

Hood – Thermal Cycler (PCR)

Απομόνωση DNA Η απομόνωση DNA από ένα δείγμα είναι ένα σύνολο φυσικών και χημικών διαδικασιών: Θραύση των κυττάρων μέσω λείανσης, ώστε να υπάρχει DNA έξω από τα κύτταρα Αφαίρεση μεμβρανικών λιπιδίων, πρωτεϊνών και RNA με τη χρήση CTAB, πρωτεασών και RNAσων, ώστε δείγμα να είναι καθαρότερο Χρήση αλκοόλης για τον περαιτέρω καθαρισμό του DNA.

Πειραματική Πορεία για την απομόνωση DNA Αρχικά έγινε επιλογή ενός υγειούς φύλλου από φυτό Arabidopsis thaliana

Στη συνέχεια το φύλλο κονιορτοποιήθηκε με χρήση υγρού αζώτου. Το CTAB extraction buffer προθερμάνθηκε στο υδατόλουτρο στους 65 o C για 15 min. Έγινε προσθήκη 200 μl από CTAB και το μείγμα επωάστηκε για min στους 65 o C (εξαρτάται από το δείγμα). Έγινε προσθήκη 200 μl από Serag στο διάλυμα και ανακινήθηκε στο vortex

Vortex- διαλύματα

Έπειτα έγινε φυγοκέντριση σε rpm για 2 min.

Μεταφέρθηκε η υδάτινη φάση (160 μl) σε καινούργιο tube. Προστέθηκαν 112 μl ισοπροπανόλη, έγινε ανακίνηση και επώαση για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν στη φυγόκεντρο για 15 min στις rpm, ώστε το DNA να σχηματίσει “pellet”.

Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και στο “pellet” προστέθηκε 0,5 ml από κρύα αιθανόλη 70%. Το δείγμα φυγοκεντρίθηκε αρκετές φορές για να αφαιρεθεί ολόκληρη η ποσότητα της αιθανόλης με πιπέττα. Το DNA διαλύθηκε σε 50 μl ddH 2 0 και παρέμεινε στον πάγο μέχρι την ηλεκτροφόρηση.

Ηλεκτροφόρηση Η ηλεκτροφόρηση είναι μία μέθοδος που επιτρέπει τον διαχωρισμό θραυσμάτων DNA με βάση το μέγεθος τους και τη δομή τους στο χώρο. Ο διαχωρισμός αυτός γίνεται λόγω της δυσκολίας κίνησης των μεγαλύτερων θραυσμάτων DNA από τους πόρους του gel. Το DNA κινείται μέσα στο gel γιατί στους πόλους του εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο και το DNA ως αρνητικά φορτισμένο έλκεται από το θετικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο (άνοδος). Στο gel προστίθεται επίσης μία χρωστική, το βρωμιούχο αιθίδιο, το οποίο εισέρχεται στη διπλή έλικα του DNA και φθορίζει όταν υπάρχει ακτινοβολία UV.

Για το gel (στα 100 ml) προστέθηκαν: 1 g αγαρόζης 1% 98 ml νερό 2 ml ΤΑΕ 50Χ 5 μl βρωμιούχο αιθίδιο Πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης

Για το διάλυμα της ηλεκτροφόρησης (1000 ml) προστέθηκαν: 980 ml νερό 20 ml ΤΑΕ 50Χ 50 μl βρωμιούχο αιθίδιο

Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης

Αλκαλική λύση Η αλκαλική λύση είναι μία διαδικασία που ακολουθείται για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA από βακτηριακές καλλιέργειες. Κατά τη μέθοδο αυτή ένα ισχυρά αλκαλικό διάλυμα καταστρέφει τις μεμβράνες των βακτηρίων και αλλάζει τη δομή του πλασμιδιακού και χρωμοσωμικού DNA. Στη συνέχεια προστίθεται οξικό κάλιο για να ανέβει το pH σε φυσιολογικά επίπεδα και να επανέλθει το πλασμιδιακό αλλά όχι το χρωμοσωμικό DNA στην αρχική του μορφή. Στη συνέχεια το πλασμιδιακό DNA απομονώνεται και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για άλλες διαδικασίες όπως η ηλεκτροφόρηση.

Διαλύματα αλκαλικής λύσης Στην μέθοδο έγινε χρήση 3 διαλυμάτων: P1: 20 μl EDTA 50 μl Tris-HCl, pH=8.0, 1M 10 μl RNAse 920 μl ddΗ 2 0 P2: 930 μl ddΗ μl SDS 20% 20 μl NaOH 10N P3: 3M CH 3 COOK 5M CH 3 COOH

Πρωτόκολλο αλκαλικής λύσης Αρχικά μεταφέρθηκαν 1,5 ml από την υγρή καλλιέργεια σε eppendorfs και φυγοκεντρίθηκαν στις rpm για 1-2 min και το υπερκείμενο απορρίφθηκε Προστέθηκαν 200 μl από το P1 και έγινε ανάδευση με πιπέττα. Έγινε η προσθήκη 200 μl P2 για 3 λεπτά αυστηρά ώστε να γίνει η λύση των κυτταρων.

Στη συνέχεια προστέθηκαν 200 μl από το διάλυμα P3 και έγινε ανάδευση μέχρι να σχηματιστούν λευκά κομμάτια.Το διάλυμα αφέθηκε στον πάγο για 15 min.

Το διάλυμα πέρασε από φυγοκέντριση στις rpm για 30 min και 4 ο C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε προσεκτικά αποφέυγωντας τα λευκά συσσωματώματα (κυτταρικά τοιχώματα). Στο διάλυμα προστέθηκε παγωμένη (-20 o C) αιθανόλη 100% μέχρι να γεμίσει το eppendorf. Έγιναν επαναλαμβανόμενες φυγοκεντρίσεις ώστε να απομακρυνθεί όλος ο όγκος της αιθανόλης γιατί παρεμποδίζει την αντίδραση.

Το DNA επαναδιαλύθηκε σε 40 μ l ddH 2 O. To διάλυμα πέρασε από μικρές διάρκειες ανάδευσης στο vortex και μικρές φυγοκεντρίσεις (short spin) Διατήρηση στον πάγο (-20 o C) μέχρι την ηλεκτροφόρηση και την εξέταση του gel κάτω από λάμπα UV.

Αποτελέσματα αλκαλικής λύσης