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实验四 质粒的电泳检测和 酶切. 电泳检测:质粒电泳一般有三条带,分别为 质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 电泳检测:质粒电泳一般有三条带,分别为 质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 吸光值检测:采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值,若吸光值 260nm/280nm 的比 值介于.

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Παρουσίαση με θέμα: "实验四 质粒的电泳检测和 酶切. 电泳检测:质粒电泳一般有三条带,分别为 质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 电泳检测:质粒电泳一般有三条带,分别为 质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 吸光值检测:采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值,若吸光值 260nm/280nm 的比 值介于."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 实验四 质粒的电泳检测和 酶切

2 电泳检测:质粒电泳一般有三条带,分别为 质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 电泳检测:质粒电泳一般有三条带,分别为 质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 吸光值检测:采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值,若吸光值 260nm/280nm 的比 值介于 1.7 - 1.9 之间,说明质粒质量较好, 1.8 为 最佳,低于 1.8 说明有蛋白质污染,大于 1.8 说明 有 RNA 污染。 吸光值检测:采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值,若吸光值 260nm/280nm 的比 值介于 1.7 - 1.9 之间,说明质粒质量较好, 1.8 为 最佳,低于 1.8 说明有蛋白质污染,大于 1.8 说明 有 RNA 污染。 质粒检测 :

3 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖熔化后 再凝固后能形成带有一定空隙的固体 基质的特性,其孔隙的大小取决于琼 脂糖的浓度。在电场的作用及中性 PH 缓冲条件下,带负电的核酸分子就可 以向阳极移动。 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖熔化后 再凝固后能形成带有一定空隙的固体 基质的特性,其孔隙的大小取决于琼 脂糖的浓度。在电场的作用及中性 PH 缓冲条件下,带负电的核酸分子就可 以向阳极移动。

4 胶浓度(%) 线性 DNA 分 子大小( kb ) ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 3 在一定电场强度下, DNA 分子的迁 移取决于分子筛效应,即 DNA 分 子本身的大小和构型 ( 相对分子质 量不同的 DNA 片段泳动速度不一 样 ) 。 DNA 分子的迁移速度与相对 分子质量的对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子 质量的 DNA ,也可以分离相对分 子质量相同,但构型不同的 DNA 分子:一般来说,其中闭环结构 泳动最快,其次为线性结构,最 慢的可能是单链开环。

5 限制性内切酶的相关基础知识 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DN A中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶 都是从原核生物中发现,它们的功能犹似 高等动物的免疫系统, 用于抗击外来D NA的侵袭。 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DN A中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶 都是从原核生物中发现,它们的功能犹似 高等动物的免疫系统, 用于抗击外来D NA的侵袭。 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要 工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶及 末端修饰酶等一起被称为工具酶。限制性 内切酶是 DNA 重组的重要工具。 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要 工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶及 末端修饰酶等一起被称为工具酶。限制性 内切酶是 DNA 重组的重要工具。

6 限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制性酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断 核酸的情况不同,分为三类:Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。 按限制性酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断 核酸的情况不同,分为三类:Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。 II 型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在 该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制 性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因 此,这种限制性内切酶是 DNA 重组技术中最常用 的工具酶之一。 II 型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在 该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制 性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因 此,这种限制性内切酶是 DNA 重组技术中最常用 的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或 6 个核苷酸,少数也有识别 5 个核苷酸以及 7 个、 8 个、 9 个、 10 个和 11 个核苷酸的。这种酶的切割 可以有两种方式: 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或 6 个核苷酸,少数也有识别 5 个核苷酸以及 7 个、 8 个、 9 个、 10 个和 11 个核苷酸的。这种酶的切割 可以有两种方式:

7 每种酶有特异的识别核酸序列,称为酶切位点, 一般为回文序列。 每种酶有特异的识别核酸序列,称为酶切位点, 一般为回文序列。 所有的限制性内切酶切割 DNA 均产生含 5′ 磷 酸基和 3′ 羟基基团的末端 。 所有的限制性内切酶切割 DNA 均产生含 5′ 磷 酸基和 3′ 羟基基团的末端 。 质粒的酶切

8 酶切反应中应注意以下几个问题: .内切酶: 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染; 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端; 内切酶的用量 根据内切酶单位和DNA用量而定,通常 1u 指在适当条件下, 1 小时内完全酶解1 ug 特定DNA底 物所需要的限制性内切酶量,使用中一般以1 ug DNA 对 2-3 u 酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系10%,因内切酶中含 50%甘油,体系中甘油超过5%会抑制内切酶活力; 使用时防止操作中对内切酶的污染。

9 DNA: 作为内切酶底物,DNA应该具备一定的纯度,其溶液中 不能含酚、氯仿、乙醚、 SDS 、 EDTA 、高盐浓度、酒精 等,这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过: 增加酶作用单位数( 10~20U/ug DNA )、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。

10 反应缓冲液: 反应缓冲液主要由 Tris·HCl 、 NaCl 、 Mg2 + 组成,其中 Mg2 + 为内切酶辅基; Tris·HCl 维持反应体系 pH 值在 之间; NaCl 浓度不同形成3种级别的离子强度: 低盐( 10mM NaCl) 中盐( 50mM NaCl ) 高盐( 100mM NaCl ) 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。

11 酶解温度与时间: 大多数限制酶反应温度为37℃,如 EcoR Ⅰ, Hind Ⅲ, BamH Ⅰ, Pst Ⅰ等,也有如 Bcl Ⅰ需在50℃下进行反应, 3 小时即可充 分酶解。

12 实验方法: 按下表分别加入各试剂(注意限制性内切酶最后加 入且在冰上操作)于 Eppendorf 管中。 无菌水 12μl DNA 5μl 10×buffer 2μl 内切酶 1μl 总体积: 20μl


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