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1 食品与生物工程学院 王章存 枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的测定 生物化学实验之五. 2 一、实验目的 1. 加深了解酶活力的概念。 2. 学习和掌握测定蛋白酶活力的方法。 要重点掌握测定酶活的程序: 将酶液稀释到一定程度; 将酶液稀释到一定程度; 最适条件下进行酶促水解反应; 最适条件下进行酶促水解反应;

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Παρουσίαση με θέμα: "1 食品与生物工程学院 王章存 枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的测定 生物化学实验之五. 2 一、实验目的 1. 加深了解酶活力的概念。 2. 学习和掌握测定蛋白酶活力的方法。 要重点掌握测定酶活的程序: 将酶液稀释到一定程度; 将酶液稀释到一定程度; 最适条件下进行酶促水解反应; 最适条件下进行酶促水解反应;"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 1 食品与生物工程学院 王章存 枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的测定 生物化学实验之五

2 2 一、实验目的 1. 加深了解酶活力的概念。 2. 学习和掌握测定蛋白酶活力的方法。 要重点掌握测定酶活的程序: 将酶液稀释到一定程度; 将酶液稀释到一定程度; 最适条件下进行酶促水解反应; 最适条件下进行酶促水解反应; 测定反应量; 测定反应量; 根据酶活单位定义计算酶活力。 根据酶活单位定义计算酶活力。

3 3 二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可 用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后,反应体 系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规 定酶活力单位 (U) 为一定条件下每分钟分解 1μg 酪氨酸 所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反 应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与 Folin- 酚试剂反应 生成蓝色化合物,该蓝色化合物在 680nm 处有最大光 吸收,其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化,可 计算出蛋白酶的活力。

4 4 三、实验仪器和试剂 仪器 : 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤 纸、玻璃漏斗。 枯草杆菌蛋白酶:称取 1g 枯草杆菌蛋白酶粉,用少量 0.02mol/L , pH7.5 磷酸缓冲液溶解并定容至 100mL ,震荡 15 分钟,使充分溶解,干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使 用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。 试剂 mol/L 盐酸溶液 mol/L 氢氧化钠溶液 mol/L 碳酸钠溶液 4. 10% 三氯乙酸溶液 5. 标准酪氨酸溶液 (50μg/mL) :称取 12.5mg 以烘干至恒重 的酪氨酸,用 0.2mol/L 盐酸约 30mL 溶解后,蒸馏水定容 至 250mL 。 6. 酪蛋白溶液 (0.5%) :称取 1.25g 酪蛋白,用 0.04mol/L 氢 氧化钠溶液 (20mL) 溶解,再用 0.02mol/LpH7.5 磷酸缓冲液 定容到 250mL 。

5 mol/LpH7.5 磷酸缓冲液: 称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4. 12H2O)7.16g ,用水定容至 100mL(A 液 ) ;称取磷酸二氢钠 (Na2HPO4.12H2O)3.12g ,用水定容至 100mL(B 液 ) 。 取 A 液 84mL , B 液 16mL 混合后,得到 0.2mol/LpH7.5 磷 酸缓冲液,可长期存放。临用时稀释 10 倍即可。 8. Folin- 酚试剂: 在 2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠 (Na2WoO4. 2H2O)100g , 钼酸钠 (Na2WoO4. 2H2O)25g ,蒸馏水 700mL , 85% 磷 酸 50mL 以及浓盐酸 100mL ,充分混匀后,微火回流加热 10 小时。再加入硫酸锂 150g ,蒸馏水 50mL 和液溴数滴, 摇匀后开口继续煮沸 15min ,以驱赶过剩的溴。冷却后加 蒸馏水定容至 1000mL ,过滤,溶液呈黄绿色,置于棕色 试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准 NaOH 溶液、酚酞为 指示剂标定酸度 ( 约为 2mol/L) ,然后加水稀释至 1mol/L , 即可使用。

6 6 四、操作步骤 ( 一 ) 酪氨酸标准曲线的制作 取 6 支试管 ( 标号 0 , 1~5) , 按顺序分别加入 0.00 , 0.20 , 0.40 , 0.60 , 0.80 和 1.00mL 标准酪氨酸溶液,再用水补足 到 1.00mL ,摇匀后各加入 0.55mol/L 碳酸钠 5.0mL ,摇 匀。依次加入 Folin— 酚试剂 1.00mL ,摇匀并计时,于 30 ℃水浴锅中保温 15min 。然 后 680nm 处测定吸光值 ( 以 0 号管作对照 ) 。以酪氨酸含量 (μg) 作横坐标,吸光值为纵坐 标绘制标准曲线。

7 7 ( 二 ) 酶活力测定 1. 酶反应: 取一支试管,加入 2.0mL0.5% 的酪蛋白溶液,于 30 ℃水浴中预热 5 分钟,再加入 1.0mL 已预热好的枯 草杆菌蛋白酶液,立即计时,水浴中准确保温 10min , 从水浴中取出后,立即加入 2.0mL 的 10% 三氯醋酸 溶液,摇匀静置数分钟,干滤纸过滤,收集滤液 ( 样 品液 ) 。 另取一试管,先加入 1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋 白酶液和 2.0mL 的 10% 三氯醋酸溶液,摇匀,放置 数分钟,再加入 2.0mL0.5% 的酪蛋白溶液,然后于 30 ℃水浴保温 10min ,同样干滤纸过滤,收集滤液 ( 对照液 ) 。 以上两过程,应各做一次平行实验。

8 8 2. 滤液中酪氨酸含量的测定 取 3 支试管,分别加入 1.0mL 水、 A 液、 B 液,然后各加入 5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶 液和 1.00mLFolin- 酚试剂,摇匀按标准曲线制 作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值, 由标准曲线查出 A 、 B 液中酪氨酸含量差值, 即可推算出酶的活力单位。

9 9 实验过程示意图 酪蛋白 调 pH 值、温度,加入 调 pH 值、温度,加入 蛋白酶,反应一定时间 酪氨酸 比色测定 磷钼蓝 磷钨蓝 加入 加入 Folin- 酚试剂显色 680nm 比色 计算酶活力

10 10 五、结果处理 1. 酶活单位定义: 在上述条件下, 1min 水解酪蛋白产生 1μg 酪氨酸 的酶量为一个酶活力单位。 2. 计算 其中: A 样品 — 样品液的吸光度值 A 对照 — 对照液的吸光度值 K— 标准曲线上 A=1 时对应的酪氨酸 μg 数 V— 酶促反应液的体积 ( 本实验为 5mL) T— 酶促反应时间 ( 本实验为 10min) N— 酶溶液稀释倍数

11 11 六、注意事项 1. 实验中所用试管必须干净、干燥; 2. 各种试剂的取用量要准确,用吸量管量取; 3. 过滤时用干滤纸 4.Folin- 酚试剂的显色条件为碱性。

12 12 七、思考题 1 、实验中加入碳酸钠的目的是什么? 2 、蛋白质与 Folin- 酚试剂也可显色,实验中如 何排除为水解蛋白对测定结果的干扰? 3. 实验中哪些因素可能引起误差,如何操作避 免这些误差。


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