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蔬菜中 有机磷和氨基甲酸酯类 农药残留量快速检测 — 酶抑制率法 ( 分光光度法 ) 03088007 陈夏琴.

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1 蔬菜中 有机磷和氨基甲酸酯类 农药残留量快速检测 — 酶抑制率法 ( 分光光度法 ) 陈夏琴

2 分光光度法的原理简介 酶抑制率法 ( 分光光度法 )

3  吸光光度法 : 基于物质对光的选择 性吸收而建立的分析方法, 包括比 色法和分光光度法。  不同物质由于结构不同, 所吸收光 的波长及吸收程度不同, 这就是物质 对光的选择性吸收

4 当一束强度为 I 0 的平行单色光通过一均匀的吸收介质时, 由于吸光物质分子与光子的作用,一部分光子被吸收, 一部分光子透过介质。设透过的光强度为 I t ,则透光率 T 定义为 T=I t /I 0 ,而- lgT 称为吸光度 A ,即 A=- lgT=lgI 0 /I t 入射光 I 0 透射光 I t

5  测量某物质对不同波长单色光的吸收程度,以波长( )为横 坐标,吸光度( A )为纵坐标,绘制吸光度随波长的变化可得 一曲线,此曲线即为吸收光谱。  不同浓度的同一物质,它的最大吸收波长是不变的,但吸光度 随浓度增大而增大。  在最大吸收波长处测量吸光度,其灵敏度最高。

6 有色溶液对某一波长光吸收的强度与有色物质的浓度 c 及吸 光溶液的液层厚度 b 成正比,称为光吸收定律或朗伯-比尔 定律,其数学表达式为 A=εbc A C A T % T 式中: b 为液层厚度,单位为 cm ; c 为浓度,单位为 mol.L-1 ; ε 为摩尔吸光系数,单位为 L.mol-1.cm-1 。

7 光电比色法分光光度法(紫外 - 可见分光光度法) UV-VIS Ultraviolet Visual Spectroscopy 光源单色器吸收池检测器显示 I0I0 ItIt 参比 样品 入射光 I 0 透射光 I t

8 原理 在一定条件下,有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱 酯酶正常功能有抑制作用,其抑制率与农药的浓度 呈正比。正常情况下,酶催化神经传导代谢产物 (乙酰胆碱)水解,其水解产物与显色剂反应,产 生黄色物质,用分光光度计在 412nm 处测定吸光度 随时间的变化值,计算出抑制率,通过抑制率可以 判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类 农药的存在。

9 试剂 pH8.0 缓冲溶液 分别取 11.9g 无水磷酸氢二钾与3. 2 g 磷酸二氢钾,用 1000mL 蒸馏水溶解。 显色剂 分别取 160mg 二硫代二硝基苯甲酸 ( DTNB )和 15.6mg 碳酸氢钠,用 20mL 缓冲溶液溶 解, 4 ℃冰箱中保存。 底物:取 25.0mg 硫代乙酰胆碱,加 3.0mL 蒸馏水 溶解,摇匀后置 4 ℃冰箱中保存备用。 乙酰胆碱酯酶 根据酶的活性情况,用缓冲溶液溶 解, 3min 的吸光度变化 ΔA 0 值应控制在 0.3 以上。摇 匀后置 4 ℃冰箱中保存备用。 主要仪器 分光光度计, 常量天平

10 分析步骤  样品处理:选取有代表性的蔬菜样品,冲洗掉表面泥土,剪 成 1cm 左右见方碎片,取样品 1g ,放入烧杯或提取瓶中,加 入 5mL 缓冲溶液,振荡 1~2min ,倒出提取液, 静置 3~5min, 待 用。  对照溶液测试: 先于试管中加入 2.5mL 缓冲溶液,再加入 0.lmL 酶液、 0.1mL 显色剂,摇匀后于 37° C 放置 15min 以上 (每批样品的控制时间应一致)。加入 0.lmL 底物摇匀,此 时检液开始显色反应,应立即放入仪器比色池中,记录反应 3 min 的吸光度变化值 ΔA 0  样品溶液测试:先于试管中加入 2.5mL 样品提取液,其它操 作与对照溶液测试相同,记录反应 3min 的吸光度变化值 ΔA t

11 结果计算 抑制率 (%)=[(ΔA 0 -ΔA t )/ ΔA 0 ]×100 式中: ΔA 0 对照溶液反应 3min 吸光度的变化值; ΔA t 样品溶液反应 3min 吸光度的变化值;

12 结果判定 结果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。 当蔬菜样品提取液对酶的抑制率 ≥50% 时, 表 示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农 药存在,样品为阳性结果。 阳性结果的样品需要重复检验 2 次以上。

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