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残留除草剂的检测 报告人:苏晓卉 聚乙烯醇 — 苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的 制备并用于残留除草剂检测  实验原理 在非光照条件下 ,叶绿体具有降解双氧水的抗胁迫 能力,即叶绿体束缚酶能催化双氧水分解产生 O 2 ,而绝大 多数除草剂对该反应有较强的抵抗作用。  反应方程式 2H 2 O 2.

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Παρουσίαση με θέμα: "残留除草剂的检测 报告人:苏晓卉 聚乙烯醇 — 苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的 制备并用于残留除草剂检测  实验原理 在非光照条件下 ,叶绿体具有降解双氧水的抗胁迫 能力,即叶绿体束缚酶能催化双氧水分解产生 O 2 ,而绝大 多数除草剂对该反应有较强的抵抗作用。  反应方程式 2H 2 O 2."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

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2 残留除草剂的检测 报告人:苏晓卉

3 聚乙烯醇 — 苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的 制备并用于残留除草剂检测  实验原理 在非光照条件下 ,叶绿体具有降解双氧水的抗胁迫 能力,即叶绿体束缚酶能催化双氧水分解产生 O 2 ,而绝大 多数除草剂对该反应有较强的抵抗作用。  反应方程式 2H 2 O 2 叶绿体束缚酶 2H 2 O + O 2  特点 研究了 PVA-SbQ 光聚合物固定化叶绿体膜的性质, 结果证明该法固定的叶绿体束缚酶具有活性高、寿命长 和使用方便等特点。

4 聚乙烯醇 — 苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的 制备并用于残留除草剂检测 将叶绿体处理后用聚乙烯醇 - 苯乙烯吡啶 ( PVA -SbQ ) 聚合膜进行固定 ,得到固定化的叶绿体膜,该膜中叶绿体 束缚酶能催化 H 2 O 2 的分解产生氧 ,而除草剂对该指示反应 有抑制作用。利用氧电极 ,建立了新的用于检测痕量除草 剂的电流分析法。  检测痕量除草剂的电流分析法  检测范围 所检测的除草剂有阿特拉津、莠灭净、草净津、西 玛三嗪、扑草净、敌草隆和百草枯等,检测浓度范围分别 为 0.25 ~ 1.75 , 0.04 ~ 0.70 , 0.10 ~ 1.10 , 0.10 ~ 0.80 , 0.20 ~ 1.80 , 0.01 ~ 0.12 和 ~ 0.02mg/L 。

5 实验部分  叶绿体的提取和固定  实验仪器  氧分析仪及氧电极  组织捣碎机  高速冷冻离心机  BH2 型相差显微镜  超级恒温槽  H-600 型透射电子显微镜  CliniBio-128 o C 酶标仪  UTL1386-3V 型低温冰箱  将新鲜菠菜叶片破碎,分离出叶绿体,测定其中叶绿素 的含量。再利用 PVA-SbQ 光聚合技术将叶绿体固定。

6 实验部分  实验试剂和实验材料 PVA-SbQ 规格如下: SbQ 浓度为 1.34×10 - 2 mol/L , 固态物含量 %(质量分数 w %),聚合度 3500 ,皂 化度 88 %; 2 , 6 -二氯酚靛蓝( DPIP ),使用前用水 配制成 3×10 - 4 mol/L ;除草剂由原料用 2 %乙醇溶液配 制,并用该乙醇溶液逐级稀释成工作液。其浓度分别为 百草枯、敌草隆各 1 mg/L ;阿特拉津、扑草净和莠灭津 各 5mg/L 等。实验中所用试剂均为分析纯或生化试剂, 实验用水为蒸馏水;菠菜种子为香港的 “ 超级菠菜 ” ,土 壤培养 8 星期,株均重 25 g ,晴朗天气上午 9 时取叶。

7 实验方法 氧电极的内充液为 0.5mol/L KCl 溶液。首先用空气饱和 Na 2 CO 3 的蒸馏水和饱和溶液对氧测定仪进行满刻度调节和调零,然后取一 片 4mm 2 叶绿体固定化膜(或相同叶绿素浓度的叶绿体悬浮液)放 入内体积为 2mL 的反应池中,加入 pH = 7.4 的 Tris-HCl 5×10 -3 mol/L MgCl 2 缓冲溶液 1.5mL , 0.08mol/L H 2 O 2 100μL ,加水至 2mL 。插入 氧电极,反应池外层通 28 o C 恒温循环水,搅拌反应液 3min ,从记录 仪上读取放氧量 P 0 。更换反应池中的溶液和固定化膜,用微量进样 器加入一定量的除草剂,测量 P ,计算 ∆ P= P 0 - P 。每次测量都使用 新的叶绿体固定膜。测定装置如图 1 。

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9 机理讨论 与除草剂对叶绿体光合作用 Hill 反应的抑制作用的机理 不同,实验中除草剂对叶绿体抗胁迫的抑制作用主要涉及到 如下的酶反应: 在抗坏血酸过氧化酶( AA-POD )的催化作用下, H 2 O 2 被抗 坏血酸( A A )氧化生成单脱氢抗坏血酸( MDA )。 MDA 可通过歧化作用生成 AA 和脱氢抗坏血酸( DHA )。而 DHA 在脱氢抗坏血酸还原酶( DHAR )的催化作用下,与还原性 谷胱甘肽( GSH )反应生成 AA , GSH 被氧化为氧化型谷胱 苷肽( GSSG )。 GSSG 则在 GR 的作用下利用叶绿体中大量 存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( NADPH )作为电子供 体重新生成 GSH 。除草剂在避光条件下的抑制作用主要是通 过与 AA-POD 和 GR 等相关酶结合来抑制这些酶的活性。

10 影响因素 叶绿体膜的活性 根据测得的 PVA-SbQ 固定化叶绿体膜催化降解过 氧化氢产生氧气的速率来计算膜的活性。本实验采用敌 草隆作为样品(以下实验除指明外,均采用敌草隆), 结果如图 2 。由图 2 可见,保存在 -20 o C 冰箱中的 PVA- SbQ 固定膜 1 个月内活性基本没有改变; 5 个月后,膜活 性保留仍超过 50 %,满足实际测定要求。

11 影响因素 叶绿体膜的活性

12 溶液 pH 值的影响 叶绿体中酶抗胁迫 能力在中性和弱碱 性溶液中表现最强 磷酸盐缓冲液 硼酸盐缓冲液 Tris-HCl 缓冲液 碳酸氢盐缓冲液 溶液 pH 为 7.4 时,除草剂的抑制作 用最明显,放氧量差值达最大 本实验选择 pH 为 7.4 确定采用 Tris- HCl 缓冲液

13 温度的影响 温度对叶绿体束缚酶对 H 2 O 2 的抗胁迫作用和 除草剂对该指示反应的抑制作用都有影响,故对 测定结果也有影响。实验表明:在 5 ~ 27 o C ,随 温度升高空白溶液和含除草剂体系溶液的放氧量 都增大,且 ∆P 也随着增大。但温度高于 27 o C 时, 由于空白溶液的放氧量增加过快, ∆P 反而逐渐减 小。故选择测定温度为 27 o C 。

14  过氧化氢加入量的确定  H 2 O 2 降解酶的量由 PVA-SbQ 固 定膜中叶绿体的数量决定 ,对 于厚度固定的叶绿体膜 ,则由 膜面积的大小决定 。膜的面积 增加,叶绿体浓度增大 ,产生 的氧浓度大 ,除草剂抑制酶反 应引起的 ∆P 也增大,但膜片面 积达到 6mm 2 时, ∆P 反而减小。 另外,体系的空白值过大时 , 由于产生的氧浓度太大 ,易超 出仪器量程而使测定范围变窄。 故本实验膜片面积选择 4mm 2 。  膜片面积对测定的影响  利用叶绿体束缚酶在无光照的 条件下对 H 2 O 2 分解产生氧的 反应作为测定除草剂的指示反 应 ,因此 , H 2 O 2 的加入量对 测定有较大影响 。当 H 2 O 2 的 量小于 2.4×10 -4 mol/L 时,反 应的放氧量小,而使 ∆P 很小, 测定的灵敏度较低 ;当 H 2 O 2 的量大于 6.0 × mol/L 时, 反应杯中的氧气产生量太大而 使空白值增大,结果导致测定 的检测范围很窄。综合考虑各 种因素 ,确定 H 2 O 2 的浓度为 4.0×10 -4 mol/L 。

15 校准曲线 按照实验方法分别测定了不同浓度范围的阿特拉津、 莠灭净、草净津、西玛三嗪、扑草净、敌草隆及百草枯 的校准曲线,结果如表 1 。由表 1 可见,百草枯测定的浓 度最低。

16 固化与未固化叶绿体活性的差异 取含有相同浓度叶绿素的悬浮液和固化膜,分别 测出未加除草剂的放氧量 P 0 ,计算 ( P 0 - P i ) / P 0 ,结 果如表 2 。可见,利用 PVA-SbQ 固定叶绿体膜比用叶 绿体悬浮液检测的氧减少率高。即 PVA-SbQ 固定叶绿 体膜的活性高 ,用于除草剂的检测灵敏度高于叶绿 体悬浮液。

17 不同固定方法对叶绿体膜活性的影响 取冷藏于 -20 o C 冰箱中的含有相同浓度叶绿素的 PVA-SbQ 固化膜、戊二醛- 牛血清蛋白固定叶绿体膜以及海藻酸钙固 定叶绿体膜,按照上述实验方法 ,分别测定它们在放置不同 时间时对 H 2 O 2 响应的校正曲线,计算曲线的斜率,结果如表 3 。 可见, PVA-SbQ 固定叶绿体膜在不同时间下都具有比其 它两种固定化方法更高的活性。

18  样品分析  各取 500 mL 农田水样于聚四氟乙烯瓶中 ,试液经过滤 后,加入 10 mL 5 % EDTA 溶液。先直接按实验方法测 定,未检出其中除草剂的量;再分别加入敌草隆标准溶 液使其浓度分别为 0.02 mol/L , 0.05 mol/L ,测得加标回 收率为 89.2 %~ 98.7 %。另取室内盆载土壤,喷洒一定 量阿特拉津的溶液,混匀后分别称取 25g 样品于 250 mL 锥形瓶中。用本法测定,结果为 0.48μg/L ( n=3 );另 取部分该土壤样品 ,用固相萃取- HCLP 法进行测定 , 结果为 0.51μg/L 。两结果基本吻合。  重现性  每次测定时更换叶绿体膜片,分别对 0.05mg/L 敌草隆进 行测定( n = 11 ),得 RSD = 5.4 %。重现性与溶液、温 度等测定条件有关,为保证测量的精确度,还应使用大 小相同的 PVA-SbQ 膜。

19 结论 实验利用除草剂对叶绿体膜中束缚酶催化 H 2 O 2 分解产生氧的反应的抑制作用,提出测定 痕量除草剂的方法。该法灵敏、简便、快速, 可用来测定样品中的除草剂残留量。同时,对 PVA-SbQ 固定叶绿体膜的研究表明,该固定法 能最大程度地保持叶绿体膜中 H 2 O 2 抗胁迫酶的 活性,并且保存寿命长,使用方便。

20 References

21 Thank you ~


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