Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

 Τα κύρια λεμφοκύτταρα στο αίμα είναι τα Τ  Ωστόσο τα ίδια δεν αναγνωρίζουν αντιγόνα του οργανισμού,σε περίπτωση που δεν αναφερόμαστε σε αυτοάνοσο,άρα.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: " Τα κύρια λεμφοκύτταρα στο αίμα είναι τα Τ  Ωστόσο τα ίδια δεν αναγνωρίζουν αντιγόνα του οργανισμού,σε περίπτωση που δεν αναφερόμαστε σε αυτοάνοσο,άρα."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1

2  Τα κύρια λεμφοκύτταρα στο αίμα είναι τα Τ  Ωστόσο τα ίδια δεν αναγνωρίζουν αντιγόνα του οργανισμού,σε περίπτωση που δεν αναφερόμαστε σε αυτοάνοσο,άρα και κύτταρα όγκων  Πολλές προσπάθειες για επαγώμενη ανοσοανταπόκριση(κυρίως με χρήση αντισωμάτων)που δεν είχαν σαφές αποτέλεσμα καθώς οι μηχανισμοί που εμπλέκονται δεν είναι γνωστοί

3  Στην έρευνα αυτή έγινε χρήση χιμαιρικής υπεραντιγονικής πρωτείνης  Αποτελούνταν από 2 κύριες πρωτείνες: τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα του ανθρώπου (epidermal growth factor,EGF) και την σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Α(staphylococcal enterotoxin A,SEA) με τη μετάλλαξη D227A  Η πρωτείνη αυτή οδηγήθηκε στην περιοχή του όγκου και προκάλεσε ανοσολογική απόκριση στην περιοχή

4 Όγκοι Συμπαγείς (δεν περιέχουν κύστες ή περιοχές με υγρό σάρκωμαλέμφωμακαρκίνωμα«Όγκοι αίματος»λευχαιμία

5  Έχει παρατηρηθεί πως στα σαρκώματα υπάρχει υπερέκφραση υποδοχέων EGF (EGF-R),οι οποίοι μπορούν να φωσφορυλιωθούν απο τoν EGF σε ένα κατάλοιπο τυροσίνης στη θέση 1068  Παράλληλα η SEA οδήγησε τα Τ-λεμφοκύτταρα κοντά στον όγκο  Τα Τ-λεμφοκύτταρα έκκριναν διατιτρήνες και κοκκιοένζυμα ως ανταπόκριση στην SEA αλλά αυτά στόχευσαν και καρκινικά κύτταρα που βρίσκονταν κοντά  Τέλος τα ανοσοποιητικά κύτταρα έκκριναν και κυτταροκίνες που βοήθησαν σε πιο γενικευμένη ανταπόκριση

6

7 Κάποια πράγματα για το ανοσοποιητικό…

8 Β-ΛεμφοκύτταραΠλασματοκύτταραΚύτταρα Μνήμης

9 Τ-λεμφοκύτταρα Βοηθητικά(CD4)ΜνήμηςΡυθμιστικά Κυτταροτοξικά(CD8+)

10 Κάποια πράγματα για το ανοσοποιητικό…

11  Προετοιμασία πρωτείνης  Δημιουργία μοντέλων σε ποντίκια  Σηματοδότηση, με φθορίζουσες ουσίες, της EGF-SEA  Κυτταρομετρία ροής  Ανοσοιστοχημεία  Μέτρηση ποσότητας κυτοκινινών  Δοκιμασία TUNEL  Απεικόνιση ιστών

12  Χρησιμοποιήθηκε ο φορέας pET22b στον οποίο εισάγαμε 3 αλληλουχίες:  Ένα συνθετικό τμήμα DNA που κωδικεύει ένα σύντομο συνδετικό πεπτίδιο (VDKLGGGGSGGGGSGGGGS)  To γονίδιο για την SEA με τη μετάλλαξη D227A (μοριακό βάρος 34,6kDa)  Το γονίδιο για την ΕGF (μαζί με την SEA 41,2kDa)

13  Στη συνέχεια εισάγουμε το φορέα σε βακτήριο (E.Coli) και έπειτα από πολλαπλασιασμό των βακτηρίων λύσαμε τα κύτταρα και ‘καθαρίσαμε’ τις πρωτείνες με τη χρήση χρωματογραφίας συγγένειας με ακινητοποιημένο μεταλλικό ιόν (Νi++).  Οι πρωτείνες αναδιπλώθηκαν με τη μέθοδο GSSG και με διαπίδυση σε αργινίνη  Τα τελικά προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE

14  Ποντίκια (αρσενικά ICR)4-5 εβδομάδων,18-22g το καθένα  Εισάγαμε σε αυτά,υποδόρια στη δεξιά ‘μασχάλη’, 2 εκκατομύρια κύτταρα S180,τα οποία είχαμε εισάγει σε αλατούχο διάλυμμα (PBS, phosphate-buffered saline)  Τα χωρίσαμε σε τρία γκρουπ των 15  Έγινε έγχυση,μετά από δύο μέρες,διαλυμάτων 0,2ml 0,9% ΝαCl(control),SEA(250pmol) και EGF-SEA (250pmol),ενδοπεριτοναϊκά,δύο φορές τη μέρα  Οι μετρήσεις άρχισαν την ένατη μέρα

15  Με φθορίζουσες ουσίες  Συγκεκριμένα με Kodak X-SIGHT 670 TFP(tetrafluorophenyl=τετράφθοροφαινυλο-) εστέρα  Σύζευξη χρωστικών με τις πρωτείνες μας σε ρυθμιστικό διά/μα φωσφορικού νατρίου->κατάλληλες χρωστικές για κατάλληλες πρωτείνες,ενώ ασύζευκτες χρωστικές ουδετεροποιούνται με χλωριούχο αμμώνιο  Οι σηματοδοτημένες πρωτείνες με τα υπόλοιπα χρώματα υφίστανται εξαλάτωση σε στήλη Sephadex G- 25 για να διαχωριστούν ενώ μετριέται η απορρόφηση φωτός (φασματοφωτομετρία) για να δούμε το βαθμό σηματοδότησης....

16  Πιο συγκεκριμένα ανάλυση FACS(fluorescence- activated cell sorter)  Μέτρηση ικανότητας της σηματοδοτημένης EGF-SEA να προσδένει κύτταρα σαρκώματος  Κύτταρα σαρκώματος συλλέχθηκαν,φυγοκεντρήθηκαν,εισάχθηκαν σε δ/μα PBS και επωάστηκαν με διάφορες ποσότητες EGF-SEA και στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS

17  Ιστοί από 8 ποντίκια από κάθε γκρουπ επεξεργάστηκε σε φορμαλίνη,παραφίνη,ξυλινη,αιθανολη,τα κύτταρα επωάστηκαν σε:1) δ/μα Η2Ο2 για να εμποδιστούν οι ενδογενείς υπεροξειδάσες,2)δ/μα μπλοκαρίσματος πρωτεϊνών που περιείχε ανοσοποιημένο ορό κουνελιού,3)δ/μα αντισωμάτων:ειδικών για CD4 πολυκλωνικών από κουνέλι,ειδικών για CD8 πολυκλωνικών από κουνέλι,πολυκλωνικών για ιντερφερόνη-γ,παράγοντα νέκρωσης όγκου- α,Fas,διατιτρηνών,κοκκιοενζύμων-Β,όπως επίσης και ειδικών για φωσφορυλιωμένους EGFRs από ποντίκια  Για αυτα χρησιμοποιήθηκαν anti-rabbit και anti- mouse αντισώματα

18  Παράλληλα δημιουργήθηκαν και αντισώματα για την ανίχνευση της SEA  Τέλος οι ιστοί ξεπλύθηκαν με PBS και χρώστηκαν με αιματοξυλίνη για μελέτη

19  Αρκετά υψηλά επίπεδα ιντερφερόνης-γ,interferon-γ (IFN-γ) και παράγοντα νέκρωσης όγκου-α,tumor necrosis factor-α(TNF-α)  Χρήση ELISA (μάλλον διπλής) για ανίχνευση και της ύπαρξης και της ποσότητας

20 Το ίδιο το γεγονός απελευθέρωσης τους όμως σημαίνει πως ο οργανισμός έχει αρχίσει την ανταπόκριση του στα ξένα αντιγόνα.Επίσης παρατηρούνται και ‘σημεία’ φλεγμονής που προκαλούν οι κυτταροκίνες μας…

21  Αξιολόγηση των ποσοτήτων κατακερματισμένου DNA  Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick- End Labeling  Σε εγκοπή στο DNA,η τρανσφεράση θα προσθέσει dUTP  Χρήση In Situ  Τα νουκλεοτίδια είναι σεσημασμένα

22 Αφότου ενέθηκαν τα προαναφερθέντα διαλύματα στα ποντίκια,αυτά αναισθητοποιήθηκαν για να παρακολουθηθεί η πορεία της EGF-SEA στους όγκους.Η παρακολούθηση διήρκησε 62 ώρες ενώ χρησιμοποιήθηκε απεικόνιση ‘In Situ’ φθορισμού IVIS Kinetic με ειδικό φίλτρο για συλλογή εκπομπών φωτονίων μήκους κύματος nm

23

24

25

26

27

28

29  Η EGF-SEA ‘προσδέθηκε’ στα κύτταρα του όγκου  Η EGF φωσφορυλίωσε τους EGF υποδοχείς που υπερεκφράζονται στα σαρκώματα  Η SEA προκάλεσε ανοσολογική απάντηση κοντά στους όγκους  Τα κύτταρα των όγκων περιήλθαν σε απόπτωση

30  Τα κυτταροτοξικά Τα-λεμφοκύτταρα παρήγαγαν διατρητίνες και κοκκιοένζυμα-Β και οδήγησαν τα κύτταρα των όγκων σε απόπτωση  Παράλληλα επάγεται και απόπτωση των κυττάρων μέσω του μονοπατιού της Fas που ενεργοποιείται  Τα καρκινικά κύτταρα εμφάνισαν αυξημένη έκφραση Fas

31

32  Αξίζει να αναφερθεί όμως πως τα ποντίκια με την SEA απλώς δεν εμφάνισαν την ίδια απάντηση  Ενώ στα ποντίκια με τη χιμαιρική πρωτείνη παρατηρήσαμε ανοσολογική ανταπόκριση στην περιοχή του όγκου, στα ποντίκια με την SEA αρκετά T- λεμφοκύτταρα γύρισαν στον σπλήνα ενώ ήταν αυξημένες οι κυτταροκίνες στο αίμα αλλά και στο σπλήνα

33

34  Pubmed  Wikipedia  Βιοχημεία Berg,Tymoczko,Stryer πανεπιστημιακές εκδόσεις Κρήτης  Arousing the fury of the immune system  Immunology,David Male  Ανοσοβιολογία,Χατζηπέτρου  Immunology,Hood,Weissman,Wood,Wilson


Κατέβασμα ppt " Τα κύρια λεμφοκύτταρα στο αίμα είναι τα Τ  Ωστόσο τα ίδια δεν αναγνωρίζουν αντιγόνα του οργανισμού,σε περίπτωση που δεν αναφερόμαστε σε αυτοάνοσο,άρα."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google