Ενζυμική Βιοτεχνολογία

Παρουσίαση με θέμα: "Ενζυμική Βιοτεχνολογία"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Ενζυμική Βιοτεχνολογία
Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων

2 Ορισμός Ενζύμου Μια πρωτεΐνη που έχει την ιδιότητα της καταλύσης, δηλαδή της μετατροπής ενός υποστρώματος σε προϊόν

3 Κατάταξη Ενζύμων με βάση τον όγκο παραγωγής και αγοράς
Μεγάλου όγκου ή βιομηχανικά ένζυμα (industrial enzymes) Μικρού όγκου ή υψηλής προστιθέμενης αξίας ένζυμα (high added value enzymes) Εξωκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Χαμηλή καθαρότητα Μεγάλες ποσότητες παραγωγής Φθηνό κόστος παραγωγής και αγοράς Ενδοκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Υψηλή καθαρότητα Μικρές ποσότητες παραγωγής Ακριβό κόστος παραγωγής και αγοράς

4 Μικροβιακής Προέλευσης
Προέλευση Ενζύμων Ζωικής Προέλευσης Λιπάση (πάγκρεας χοίρου, βιομηχανία καλλυντικών) Θρυψίνη (πάγκρεας μόσχου και χοίρου, επεξεργασία δέρματος) Αφυδρογονάσες (καρδιακό ή σκελετικό μυ θηλαστικών, διαγνωστική και αναλυτική επιστήμη) Φυτικής Προέλευσης Παπαΐνη (Carica Papaya, ζυθοποιία) Οξαλοξική οξειδάση (ρίζες κριθαριού, προσδιορισμός οξαλοξικού οξέος) Υπεροξειδάση (ραφανίδα, ένζυμο δείκτης ενζυμικών αντιδράσεων) Μικροβιακής Προέλευσης Περιοριστικά ένζυμα (διάφοροι μικροοργανισμοί, μοριακή βιολογία)

5 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών
Τι είναι; Συστήματα παραγωγής πρωτεϊνών ως αποτέλεσμα έκφρασης ανασυνδυασμένων γονιδίων που κωδικοποιούν τα επιθυμητά πολυπεπτίδια Πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης διατηρούν και εκφράζουν τα επιθυμητά ανασυνδυασμένα γονίδια στα συστήματα έκφρασης Συστήματα έκφρασης: προκαρυωτικοί και ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί, κυτταροκαλλιέργειες ανώτερων οργανισμών, φυτά, ζώα, cell-free συστήματα έκφρασης...

6 Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών
Βακτήρια Cell-free Έντομα Ζύμες Διαγονιδιακά φυτά Κύτταρα θηλαστικών Διαγονιδιακά ζώα

7 Πλασμιδιακός φορέας έκφρασης
Ετερόλογη Έκφραση: Τι χρειαζόμαστε; DNA με το γονίδιο στόχο Πλασμιδιακός φορέας έκφρασης Σύστημα έκφρασης Συνθήκες έκφρασης

8 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών
Κύριες εφαρμογές: Παραγωγή πρωτεϊνών που συναντώνται σε χαμηλές ποσότητες στις φυσικές πηγές, για άμεση απομόνωση και λειτουργική-δομική τους ανάλυση. Βιομηχανική παραγωγή πρωτεϊνών για βιοφαρμακευτική χρήση. Χαρακτηρισμό πρωτεϊνών που έχουν ανιχνευθεί μέσω τεχνικών reverse genetics. Δομική και λειτουργική ανάλυση πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας τεχνικές μεταλλαξογέννεσης Παραγωγή πρωτεϊνών με νέες ιδιότητες εφαρμόζοντας τεχνικές πρωτεϊνικής μηχανικής

9 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών
Escherichia coli: το πιο χρησιμοποιημένο βακτήριο για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Γρήγορο, φθηνό, εύκολο (όταν δουλεύει) Εύκολη κλωνοποίηση και γενετική τροποποίηση Μικρός κόστος καλλιέργειας Γρήγορη ανάπτυξη και έκφραση

10 Γενετικά ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans Aspergilus niger, Aspergillus oryzae, Pishia pastoris ……… Τεχνική κλωνοποίησης ανασυνδυασμένου DΝΑ Επιλογή πλασμιδιακού φορέα έκφρασης Επαγωγή υπερέκφρασης Αντίδραση συγκόλλησης Μετασχηματισμός Κυττάρων έκφρασης PCR στο αντίστοιχο γένωμα

11 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών
Βασικά βήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών: Απομόνωση και πολλαπλασιασμός του γονιδίου στόχου (PCR) Μεταφορά του γονιδίου σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης (pET) Μετασχηματισμός E. coli κυτταρικής σειράς έκφρασης (Bl21DE3) Μικρής κλίμακας υπερέκφραση Έλεγχος έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (ενζυμική δοκιμή, western blot) Μεγάλης κλίμακας υπερέκφραση Απομόνωση πρωτεΐνης (Χρωματογραφία)

12 Παραγωγή ανθρώπινων πρωτεϊνών μέσω γενετικά ανασυνδυασμένων μικροοργανισμών
Πρωτεΐνη Παθήσεις α1-Αντιθρυψίνη Εμφύσημα Αδρενοκοτρικοτροπική ορμόνη Ρευματικές Παθήσεις Παράγοντας VIII Αιμοφιλία Παράγοντας ΙΧ Ενδορφίνες Πόνος Αιμογλοβίνη Αναιμία Ινσουλίνη Διαβήτης Λεμφοτοξίνη Καρκίνος Αυξητική ορμόνη Αναπτυξιακά προβλήματα Ιντερλευκίνες Καρκίνος, Ανοσολογικές παθήσεις Ιντερφερόνες (α, β, γ) Ιώσεις, Καρκίνος Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας Εγκαύματα Νευρικός αυξητικός παράγοντας Τραύματα νευρώνων

13 (Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης)
Οργανισμός (Πηγή πρωτεΐνης) Ανιούσα Επεξεργασία (Έκφραση πρωτεΐνης) Κατιούσα Επεξεργασία (Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης) Καθαρό Πρωτεϊνικό Παρασκεύασμα

14 Κατιούσα Επεξεργασία Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμός Στερεών και Υγρών
Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Τελικό Στάδιο Μορφοποίηση Προϊόντος

15 Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών
Φυγοκέντρηση Ίζημα : Ενδοκυτταρικές, μεβρανικές πρωτεΐνες Υπερκείμενο : Εξωκυτταρικές πρωτεΐνες Φυγοκέντρηση σε ειδικά δοχεία Φυγοκέντρηση συνεχούς ροής

16 Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών
Υπερδιήθηση: 0, μm Διήθηση Μικροδιήθηση : 0,005-2μm

17 Διάρρηξη Κυττάρων Μηχανικές Τεχνικές Εφαρμογή υπερήχων Εφαρμογή υψηλής πίεσης Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους Μη Μηχανικές Τεχνικές Ωσμωτικό σοκ Αλκαλική λύση (pH 11-12,5) Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (απορρυπαντικά) Οργανικοί διαλύτες (τολουόλιο, ακετόνη) Ενζυμική λύση (λυσοζύμη) Πάγωμα-ξεπάγωμα

18 Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων
Εφαρμογή υπερήχων Sonicator

19 Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων
Εφαρμογή υψηλής πίεσης French Press Cell Press

20 Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων
Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους υαλοσφαιρίδια

21 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων
Ωσμωτικό σοκ Μεταφορά κυττάρων από ισοτονικό διάλυμα σε υποτονικό (απιονισμένο νερό) Χρησιμοποιειται κυρίως σε κύτταρα θηλαστικών. Για μύκητες και βακτήρια πρέπει να εχει προηγηθεί άλλη τεχνική εξασθένισης του κυτταρικού τοιχώματος για να χρησιμοποιηθει η τεχνική του Ωσμωτικού Σοκ.

22 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων
Πάγωμα ξεπάγωμα Freeze-thaw Εναλλαγές κυτταρικού δ/τος από ξηρό πάγο (-78οC) στους 37οC. Χρησιμοποιειται κυρίως σε κύτταρα θηλαστικών και βακτήρια.

23 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων
Ενζυμική λύση με χρήση λυσοζύμης Υδρόλυση στρώματος πεπτιδογλυκάνης που περιβάλλει τα βακτήρια Χρησιμοποιειται κυρίως σε Gram+ βακτήρια και σε συνδυασμό με άλλη μεθοδο διάρρηξης (απορρυπαντικο, ωσμωτικό σοκ)

24 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων
Αλκαλικη λύση Χρήση διαλυμάτων NaOH Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (οργανικοί διαλύτες, απορρυπαντικά) Διαλυτοποίηση φωσφολιπιδίων κυτταροπλασματικής μεμβράνης Απαιτείται άμεση απομάκρυνση τους λόγω πρόκλησης αποδόμησης των πρωτεϊνών.

25 Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού
Κατακρήμνιση με οργανικούς διαλύτες Κατακρήμνιση σε υδατικά διφασικά συστήματα Θερμική Επεξεργασία Κατακρήμνιση με άλατα Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων (πολυαιθυλενιμίδιο, θειική στρεπτομυκίνη, βρωμιούχο κετυλο τριμεθυλαμμώνιο, πρωταμίνη, δεοξυριβονουκλεάση)

26 Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού
Χρωματογραφία Διαπερατότητας (gel filtration) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής (Ion exchange chromatography) Χρωματογραφία Συγγένειας (Affinity chromatography) Χρωματογραφία Υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (Hydrophobic interaction)

27 Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού
Fast protein liquid chromatography FPLC

28 Τελικό Στάδιο Μορφοποίησης Προϊόντος
Απομάκρυνση μικρομοριακών ουσιών (υπερδιήθηση, χρωματογραφία διαπερατότητας) Προσθήκη σταθεροποιητών ενζυμικής ενεργότητας (γλυκερόλη, άλατα, υπόστρωμα, αλβουμίνη…) Ποιοτικός έλεγχος πρωτεϊνών (ανάλογα με τις προδιαγραφές χρήσεις)

29

30 MINOTECH biotechnology
H MINOTECH biotechnology αποτελεί την μονάδα παραγωγής προϊόντων βιοτεχνολογικών εφαρμογών του ΙΜΒΒ. Είναι η μοναδική στο είδος της στα Βαλκάνια και εξειδικεύεται στην παραγωγή και απομόνωση πρωτεϊνών βακτηριακής προέλευσης. Τα προϊόντα μας απευθύνονται σε επιστήμονες που δραστηριοποιούνται σε ερευνητικούς φορείς, στην βιοτεχνολογική βιομηχανία και σε κλινικά εργαστήρια. Επιπρόσθετα η υψηλή ποιότητα τους έχει οδηγήσει στη σύναψη συνεργασιών με καταξιωμένες εταιρίες του εξωτερικού σε Ευρώπη, Ασία και Αμερική.

31 MINOTECH biotechnology
Μάρκετινγκ Έρευνα & Ανάπτυξη Παραγωγή Συσκευασία & Διανομή (Lab Supplies Scientific) Πιστοποίηση ISO 9001:2008 από την TUV HELLAS

32 MINOTECH biotechnology
Κύριες Δραστηριότητες ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΥΠΗΡΕΣΙΕΣ ΕΡΕΥΝΑ

33 MINOTECH biotechnology
Προϊόντα

34 Προϊόντα 47 Περιοριστικά Ένζυμα 4 Τροποποιητικά Ένζυμα DNA
47 Περιοριστικά Ένζυμα  4 Τροποποιητικά Ένζυμα DNA 12 μάρτυρες μοριακών βαρών DNA και 4 είδη DNA 8 Εξειδικευμένα Ένζυμα  5 Κυτοκίνες 17 Αντισώματα 7 Γενικά αντιδραστήρια

35 Προϊόντα Περιοριστικά ένζυμα
Τα μοριακά εργαλεία που έφεραν την επανάσταση στη Μοριακή Βιολογία. Πρόκειται για τα «χημικά ψαλίδια» , με τα οποία μπορούμε να κόβουμε το DNA σε συγκεκριμένα σημεία ώστε να ακολουθήσει κλωνοποίηση τους (Νομπελ Ιατρικής). Alu I   ApaL I   Asu II Ava II BamH I   Bcl I  Bgl I  Bgl II BseA I (BspM II) BseB I (BstN I) BseC I (Cla I) BshF I (Hae III) BsiS I (Hpa II) BssA I (Cfr10 I)  BstE II CspA I (Age I)  EcoR I EcoR V Hind III   Hinf I  Hpa I  Kpn I  Mbo I   MspC I (Afl II) Nae I  Nco I Nhe I Not I Nru I  PspP I (Sau96 I)  Pst I   Pvu II   Rsa I   Sal I  Sau3A I Sca I  Sfi I  SgrB I (Sac II)  Sla I (Xho I)   Sma I   SnaB I     Sph I  SseB I (Stu I)  Ssp I Sst I (Sac I)  Sty I   Taq I  XbaI

36 Τροποποιητικά ένζυμα DNA
Προϊόντα Τροποποιητικά ένζυμα DNA Taq DNA πολυμεράση.Το διάσημο ένζυμο που χρησιμοποιείται στην τεχνική ανίχνευσης DNA, PCR. T4 DNA λιγάση. Απαραίτητο ένζυμο στη διαδικασία κλωνοποίησης DNA Methyltransferase M.BseCI. Εφαρμογές σε πειράματα επιγενετικής DNA polymerase I Large (Klenow) Fragment. Χρήσιμο ένζυμο στη διαδικασία κλωνοποίησης

37 Μάρτυρες Μοριακών Βαρών DNA
Προϊόντα λ DNA/StyI λ DNA/BstEII λ DNA/EcoRI λ DNA/HindIII pBR322/HinfI pUC19/HpaII pUC19/BseBI/TaqI λ DNA/PstI λ DNA/HindIII/EcoRI 1kb DNA ladder Long Range DNA ladder 100bp DNA ladder 8000 bp 6000 5000 4000 3000 2000 1000 800 600 500 400 300 200 100 2073 1444 736 476 288 191 121 404 501,489 331 190 242 147 111,110 67 1632 396 344 298 221, 220 154 75 517, 504 8453* 7242 6369 5687* 4822 4324 3675 2323 1929 1371 1264 702 21226* 7421 5804 5643 4878 3530* 19329* 7743 6223 4254* 3472 2690 1882 1489 925 421 11501* 5077 4749 4507* 2838 2556* 2459 2443 2140 1986 1700 1159 1093 805 514 468 448 339 264,247 4973 4268 2027 1904 1584 1375 947 831 564 5148 23130* 9416 6557 4361* 2322 Μάρτυρες Μοριακών Βαρών DNA

38 Προϊόντα Εξειδικευμένα Ένζυμα (8)* Κυτοκίνες (5)* Αντισώματα (17)*
Εξειδικευμένα Ένζυμα (8)* HrcN Ps. syringae, Recombinant, E. coli HrpQA HrpQB MBP (Maltose Binding Protein) E. coli native protein ProOmpA (Precursor of Outer Membrane Protein) SecA S. lividans, Recombinant, E. coli SecB Κυτοκίνες (5)* IFN-γ (Interferon gamma) Human, Recombinant, E.coli   IL-1α (Interleukin 1 alpha) IL-1β (Interleukin 1 beta) Human, Recombinant, E.coli TNF-α (Tumor necrosis factor alpha) Αντισώματα (17)* anti-E. coli SecA anti-E. coli SecB anti-GFP anti-HrcN anti-HrcQA anti-HrcQB anti-HrcU anti-HrcV anti-HrpJ anti-HrpQ anti-human Interleukin -1ß anti-human TNF-a anti-MBP anti-mouse TNF-a anti-proOmpA anti-S. lividans SecA anti-SecY Γενικά Αντιδραστήρια (7) 0.5M EDTA, pH 8.0   10mM ATP 10mM dNTP mix   1M DTT 25mM MgCl2   6X Loading Dye Solution   Bovine Serum Albumin (10mg/ml) *Developed by Dr. Economou Laboratory, IMBB

39 MINOTECH biotechnology
Υπηρεσίες

40 Υπηρεσίες Βιοαντιδραστήρες
Ελεγχόμενη παραγωγή μικροβιακής βιομάζας σε ειδικούς βιοαντιδραστήρες χωρητικότητας 50 και 30 λίτρων. Συλλογή της μικροβιακής μάζας (φυγόκεντρος) και αποθήκευση σε ειδικούς υπερκαταψύκτες (-80οC).

41 Υπηρεσίες Απομόνωση Πρωτεϊνών
Απομόνωση πρωτεϊνών μεγάλης κλίμακας (από mg έως gr) με χρήση τεχνικών υγρής χρωματογραφίας. Αυστηρός ποιοτικός έλεγχος των τελικών δειγμάτων και συσκευασία.

42 Υπηρεσίες Έκφραση πρωτεϊνών σε E.coli (σε εξέλιξη)
Απώτερος στόχος είναι ο σχεδιασμός και η βελτιστοποίηση σχημάτων ετερόλογης έκφρασης πρωτεϊνών σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες που το χρειάζονται.

43 MINOTECH biotechnology
Έρευνα & Ανάπτυξη

44 Έρευνα & Ανάπτυξη Περιοριστικά ένζυμα Αντίστροφες μεταγραφάσες
Εμπλουτισμός της λίστας μας με περιοριστικά ένζυμα με διαφορετικό τρόπο δράσης χρήσιμα στη διαδικασία κλωνοποίησης Αντίστροφες μεταγραφάσες Τα απαραίτητα ένζυμα σε αντιδράσεις PCR που έχουν ως μήτρα μόρια RNA DNA πολυμεράσες Ανάπτυξη DNA πολυμερασών τελευταίας γενιάς (υψηλή πιστότητα και ταχύτητα σύνθεσης)

45 Έρευνα & Ανάπτυξη Τροποποιητικά ένζυμα DNA
Ταυτοποίηση νέων ενζύμων από θαλάσσια βακτήρια

46 Έρευνα & Ανάπτυξη Εκπαιδευτικές ασκήσεις
Ανάπτυξη εκπαιδευτικών ασκήσεων για την Δευτεροβάθμια και Τριτοβάθμια Εκπαίδευση Σύνθεση DNA Βακτηριακός Μετασχηματισμός

47 Παραγωγή και διανομή προϊόντων Μοριακής Βιολογίας υψηλής ποιότητας.
Με μια ματιά Παραγωγή και διανομή προϊόντων Μοριακής Βιολογίας υψηλής ποιότητας. Ενεργό τμήμα Έρευνας & Ανάπτυξης για την παραγωγή νέων προϊόντων. Συμμετοχή σε φιλόδοξα Εθνικά και Ευρωπαϊκά Ερευνητικά Προγράμματα. Εμπορικές συνεργασίες με εταιρείες του εξωτερικού Ιδανικό περιβάλλον για την εκπαίδευση νέων επιστημόνων και φοιτητών σε μεθοδολογίες Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας.