DNA μικροσυστοιχίες: βήμα προς βήμα

Παρουσίαση με θέμα: "DNA μικροσυστοιχίες: βήμα προς βήμα"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 DNA μικροσυστοιχίες: βήμα προς βήμα

2 Παραγωγή DNA ανιχνευτών
Οι επιστήμονες μπορούν να παράγουν «σπιτικές» μικροσυστοιχίες • χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (βλ. σχέδιο) που δημιουργεί χιλιάδες μικρά κομμάτια DNA με τη μορφή της διπλής έλικας • ή, εάν γνωρίζουν τη νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός γονιδίου, μπορούν να ζητήσουν από μια εταιρεία να δημιουργήσει μονόκλωνες αλυσίδες νουκλεοτιδίων με την ίδια αλληλουχία.

3 Εκτύπωση Οι μικροσυστοιχίες DNA είναι πολύ μικρές και μπορούν να φτιαχτούν στο εργαστήριο χρησιμοποιώντας γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες, όπως αυτές που χρησιμοποιούνται στη μικροσκοπία. Όπως μπορείτε να φανταστείτε, η εκτύπωση μικροσκοπικών κουκίδων DNA (κάθε κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο) σε μια τόσο μικρή επιφάνεια είναι μια δύσκολη δουλειά. Όχι μόνο πρέπει οι κουκίδες να έχουν το ίδιο σχήμα, αλλά θα πρέπει να ισαπέχουν από τις άλλες. Αυτά τα προβλήματα έχουν λυθεί με τη ρομποτική. Ένας ρομποτικός βραχίονας καθοδηγεί ένα ειδικό σετ 48 ακίδων (τριχοειδή) σε μικρές δεξαμενές που περιέχουν τους ανιχνευτές DNA που θα εκτυπωθούν στις πλάκες (επειδή οι ακίδες είναι πολύ ευαίσθητες και υπερβολικά ακριβές, το μηχάνημα είναι εξοπλισμένο μόνο με 48, οι οποίες χρησιμοποιούνται ξανά και ξανά). Ο βραχίονας βυθίζει τις ακίδες στα δείγματα, τις αφαιρεί και τις μεταφέρει πάνω σε μια σειρά από πλάκες, οι οποίες έχουν κατάλληλα επεξεργαστεί.

4 Στη συνέχεια πιέζει τις ακίδες μαλακά προς τα κάτω για λιγότερο από ένα δευτερόλεπτο, εκτυπώνοντας 200 μl DNA από κάθε ακίδα στην επιφάνεια. Όταν εκτυπωθεί η πρώτη γραμμή κουκίδων, ο βραχίονας μετακινείται στην επόμενη πλάκα κ.ο.κ., μέχρι όλες οι πλάκες αποκτήσουν μια αντίστοιχη σειρά κουκίδων. Στο τέλος της σειράς, ο βραχίονας καθαρίζει τις ακίδες, τις βουτά σε μια καινούργια σειρά δειγμάτων, επιστρέφει στην πρώτη πλάκα, και εκτυπώνει μια νέα σειρά. Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται ξανά και ξανά μέχρι να δημιουργηθεί μια σειρά πλακών οι οποίες έχουν μια «μικροσυστοιχία» κουκίδων. Μετά την εκτύπωση οι πλάκες θερμαίνονται για να μονιμοποιηθεί το DNA.

5 Απομόνωση του mRNA Για ένα πείραμα με μικροσυστοιχίες, οι επιστήμονες πρέπει απομονώσουν πρώτα το mRNA από τα κύτταρα που θέλουν να μελετήσουν. Αυτή η διαδικασία είναι σχετικά εύκολο να πραγματοποιηθεί. Για κάθε πείραμα, απαιτείται mRNA από δυο διαφορετικά είδη κυττάρων: από κύτταρα ελέγχου» και κύτταρα προς μελέτη. Για παράδειγμα, εάν ενδιαφέρεστε να μελετήσετε καρκινικά κύτταρα, θα απομονώνατε mRNA από κανονικά (μη καρκινικά) κύτταρα ως κύτταρα «ελέγχου» και mRNA από καρκινικά κύτταρα από τον ίδιο ιστό. Μετά την απομόνωση, τα μόρια mRNA πρέπει να σημανθούν με φθορίζουσες χρωστικές1 ώστε να ανιχνευτούν αργότερα στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας. mRNA από τα κύτταρα «ελέγχου» σημαίνεται με πράσινη φθορίζουσα χρωστική και mRNA των κυττάρων υπό μελέτη με κόκκινη φθορίζουσα χρωστική.

6 Υβριδοποίηση Σε αυτό το βήμα, το mRNA ελέγχου (σημασμένο πράσινο) αναμιγνύεται με το mRNA προς μελέτη (σημασμένο κόκκινο). To μίγμα εφαρμόζεται την επιφάνεια της αντικειμενοφόρου, η οποία επωάζεται στους 42° C, ώστε οι μονόκλωνες αλυσίδες του mRNA στο μίγμα υβριδοποιηθούν με το συμπληρωματικό DNA στη μικροσυστοιχία. Μετά από 12 ώρες, η μικροσυστοιχία πλένεται ώστε να αφαιρεθούν τα μόρια mRNA που δεν έχουν βρει το συμπληρωματικό τους στόχο. Η μικροσυστοιχία είναι τώρα έτοιμη για σάρωση-διάβασμα.

7

8 Σάρωση/διάβασμα της μικροσυστοιχίας – η δημιουργία μιας εικόνας
Τώρα είναι ώρα να κοιτάξουμε τα αποτελέσματα του πειράματος, για να δούμε ποιο mRNA έχει υβριδοποιηθεί σε ποιο στόχο. Αυτό γίνεται με έναν ειδικό σαρωτή laser, ο οποίος δουλεύει περίπου με τον ίδιο τρόπο που δουλεύει ο σαρωτής ενός ηλεκτρονικού υπολογιστή. Το laser σαρώνει την πλάκα και δημιουργεί μια εικόνα όμοια με αυτή στη φωτογραφία. Αλλά για μια στιγμή! Δεν υπάρχουν μόνο κόκκινες και πράσινες κουκίδες αλλά και κίτρινες και πορτοκαλί επίσης! Αυτό μπορεί να εξηγηθεί εύκολα. Είναι φανερό ότι οι κόκκινες κουκίδες περιέχουν mRNA από καρκινικό κύτταρο και πράσινες κουκίδες mRNA από μη καρκινικά κύτταρα – «ελέγχου». Αλλά τι συμβαίνει όταν ισόποσα μόρια mRNA από κυτταρικές σειρές ελέγχου και καρκινικές σειρές υβριδοποιηθούν με το ίδιο DNA στόχο; Τα πράσινα και τα κόκκινα σήματα θα συνδυαστούν και θα δώσουν κίτρινο! Θυμηθείτε ότι mRNΑ υβριδοποιείται με το συμπληρωματικό του DNA και μια κουκίδα (DNA) στη μικροσυστοιχία αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο. Με άλλα λόγια, όταν μια κουκίδα είναι κίτρινη, υπάρχουν ίσες ποσότητες mRNA του γονιδίου σε καρκινικά και κύτταρα «ελέγχου». Εάν μια κουκίδα είναι πορτοκαλί, αυτό σημαίνει ότι υπάρχει περισσότερο mRNA από το γονίδιο σε καρκινικά κύτταρα από ότι σε κύτταρα «ελέγχου». Και μαύρο σημαίνει ότι δεν υπάρχει καθόλου mRNA του γονιδίου είτε σε καρκινικά είτε σε κύτταρα «ελέγχου».

9

10 Κανονικοποίηση Σε μια μικροσυστοιχία DNA, η ένταση των κουκίδων δεν αντιπροσωπεύει πάντα το αληθινό ποσό του υβριδοποιημένου mRNA, επειδή η σήμανση του mRNA επηρεάζεται από το μέγεθος της αλυσίδας του mRNA και τον τύπο του σημαντή που χρησιμοποιείται. Μια μαθηματική διαδικασία που ονομάζεται κανονικοποίηση (normalisation) διορθώνει τις εντάσεις των σημάτων του κουκίδων, ώστε αυτές να αντικατοπτρίζουν άμεσα το ποσό του mRNA στο υβριδοποιημένο μόριο. Αφού τα δεδομένα έχουν κανονικοποιηθεί, η ανάλυση μπορεί να αρχίσει.

11 Ανάλυση και ομαδοποίηση
Θα χρειαζόταν χρόνια να αναλύσετε μια μικροσυστοιχία κουκίδα προς κουκίδα. Έτσι, οι επιστήμονες έχουν δημιουργήσει έναν τρόπο ομαδοποίησης των γονιδίων που έχουν παρόμοια συμπεριφορά σε ομάδες (clusters). Και όπως συνήθως, πολύπλοκα υπολογιστικά προγράμματα έχουν δημιουργηθεί για να εκτελεστούν αυτά τα βήματα με αυτόματο τρόπο.