Κύριοι φαινότυποι αντοχής βακτηρίων Εντεροβακτηριακά

Παρουσίαση με θέμα: "Κύριοι φαινότυποι αντοχής βακτηρίων Εντεροβακτηριακά"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Κύριοι φαινότυποι αντοχής βακτηρίων Εντεροβακτηριακά
Ι. Παπαπαρασκευάς, Λέκτορας Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ

2 Κυριότερες ομάδες αντιβιοτικών
β-Λακταμικά Αμινογλυκοσίδες Κινολόνες

3 β-Λακταμικά αντιβιοτικά
Φαινότυποι και αντίστοιχοι μηχανισμοί Παραγωγή ESBL β-λακταμασών Παραγωγή καρβαπενεμασών Παραγωγή AmpC β-λακταμασών

4 β-Λακταμάσες – Γενικά στοιχεία
Ενζυμα που αδρανοποιούν τα β-λακταμικά αντιβιοτικά Γονίδια με χρωμοσωμιακή ή πλασμιδιακή προέλευση Τα χρωμοσωμιακά ένζυμα προϋπήρχαν της εποχής των αντιβιοτικών και ανευρίσκονται σχεδόν σε όλα τα βακτήρια. Εκκρίνονται ιδιοσυστασιακά. Θεωρείται οτι αναπτύχθηκαν για να προστατεύσουν τα βακτήρια από τα φυσικά β-λακταμικά παράγωγα μυκήτων και άλλων βακτηρίων

5 β-Λακταμάσες – Γενικά στοιχεία
Οι πλασμιδιακές, φυλογενετικά προέρχονται από τις χρωμοσωμιακές, αλλά τα γονίδιά τους εδράζονται σε πλασμίδια ή μεταθετά στοιχεία. Θεωρείται ότι τα γονίδιά τους "αποσπάστηκαν” από το χρωμόσωμα και ενσωματώθηκαν σε "μετακινούμενα στοιχεία" (πλασμίδια, μεταθετά στοιχεία) Πρώτη αναφορά πλασμιδιακής β-λακταμάσης: TEM-1 Datta and Contomichalou, Nature, 1965;208:

6 β-Λακταμάσες – Μηχανισμός δράσης
Οι β-λακταμάσες χαρακτηρίζονται από σχετική ειδικότητα υποστρώματος, δηλ. το κάθε ένζυμο υδρολύει συνήθως μόνο ένα ή μια μικρή ομάδα αντιβιοτικών Μηχανισμός δράσης των β-λακταμασών: υδρόλυση του β-λακταμικού δακτυλίου με την δράση εστέρα της σερίνης (ένζυμα ομάδας σερίνης, serine β-lactamases) με την δράση ιόντων ψευδαργύρου (ένζυμα ομάδας ψευδαργύρου, zinc β-lactamases)

7 Ομαδοποίηση β-λακταμασών
Jacoby and Munoz, N Engl J Med, 2005

8 Φυλογενετικό δένδρο κυριοτέρων β-λακταμασών
OXA Διάφορες CTX-M Φυλογενετικό δένδρο κυριοτέρων β-λακταμασών SHV TEM

9 Προέλευση σε σχέση με την αμινοξική αλληλουχία
TEM-1  TEM-4

10 Κύρια είδη ευρέως φάσματος β-λακταμασών
Ενζυμα τύπου TEM και SHV Προϊόντα μεταλλάξεων TEM-1 και 2. Υδρολύουν πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες α’, β’, γ’ γενεάς, μονομπακτάμες, αναστέλλονται από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη Α) Ενζυμα τύπου CTX-M Υδρόλυση κεφοταξίμης > κεφταζιδίμης, υδρόλυση κεφεπίμης, αναστέλλονται από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη Α) Ενζυμα τύπου OXA Υδρολύουν πενικιλλίνες (έντονα την οξασιλλίνη), κεφαλοσπορίνες α’, β’, γ’ γενεάς, μονομπακτάμες, δεν αναστέλλονται πλήρως από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη D) Ενζυμα τύπου PER, GES, VEB, TLA, BES, SFO, CME, κλπ. Υδρολύουν πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες α’, β’, γ’ γενεάς, μονομπακτάμες, αναστέλλονται από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη Α)

11 Κύρια είδη ευρέως φάσματος β-λακταμασών
Ενζυμα ανθεκτικά στους αναστολείς (IRT) Δεν έχουν χαρακτηριστικά ESBL, αλλά εξετάζονται μαζί. Είναι προϊόντα μεταλάξεων ενζύμων τύπου TEM. Ανθεκτικά στο κλαβουλανικό και τη σουλμπακτάμη, αναστέλλονται από την ταζομπακτάμη.

12 Τεχνικές προσδιορισμού – Βασικές αρχές
Η παραγωγή ESBL δεν αυξάνει πάντα την ΕΑΠ του αντιβιοτικού τόσο όσο να θεωρηθεί ανθεκτικό το στέλεχος. Απαιτείται συνδυασμός μεθόδων για την ανίχνευσή τους Χρησιμοποιείται ένας αναστολέας β-λακταμικού (συνήθως το κλαβουλανικό οξύ) σε συνδυασμό με γ' γενεάς κεφαλοσπορίνη (κεφταζιδίμη ή/και κεφοταξίμη) Το κλαβουλανικό οξύ αναστέλλει την ESBL και ελαττώνει το επίπεδο αντοχής στην κεφαλοσπορίνη.

13 Έλεγχος ESBL – Αρχική διαλογή
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca CAZ ≤ 22 mm ή ≥ 1 mg/L CTX ≤ 27 mm ή ≥ 1 mg/L CRO ≤ 25 mm ή ≥ 1 mg/L ATM ≤ 27 mm ή ≥ 1 mg/L P. mirabilis CLSI, M100-S16, 2006

14 Έλεγχος ESBL – Double Disk Test
Δισκία CAZ, CTX, CRO, ATM γύρω από δισκίο AUG Το κλαβουλανικό διαχέεται από το δισκίο AUG, αναστέλλει την ESBL και δρα η κεφαλοσπορίνη

15 Έλεγχος ESBL – Επιβεβαίωση
Δισκία CAZ, CTX (30 μg) ± CLA (10 μg) Διάμετρος CAZ ≤ 5 mm από διάμετρο CAZ+CLA Διάμετρος CTX ≤ 5 mm από διάμετρο CTX+CLA Αραιώσεις CAZ, CTX (0,25-64 mg/L) ± CLA (4 mg/L) MIC CAZ ≥ 3 αραιώσεις από MIC CAZ+CLA MIC CTX ≥ 3 αραιώσεις από MIC CTX+CLA Προτυποποιημένο για E. coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis Ευαισθησία μεθόδου ~98% (σε συνδυασμό) Έλεγχος ποιότητας: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC CLSI, M100-S16, 2006

16 Διαφορές στα υπό-είδη των ESBL
Τύπου CTX-M Τύπου TEM ή SHV

17 Δοκιμασία συνέργειας δύο δισκίων Τροποποίηση ως προς την απόσταση
30 mm 20 mm

18 Deformation of TZ ellipse, CT/CTL phantom zone K. pneumoniae
P. mirabilis Deformation of TZ ellipse, CT/CTL phantom zone K. pneumoniae ESBL positive by TZ/TZL, negative by CT/CTL

19 Έλεγχος ESBL – Αναφορά Αντοχή σε όλες τις πενικιλλίνες, τις κεφαλοσπορίνες και την αζτρεονάμη ανεξάρτητα του αντιβιογράμματος Αποτελέσματα ανάλογα του αντιβιογράμματος για τους συνδυασμούς αναστολέων, τις κεφαμυκίνες και τις καρβαπενέμες CLSI, M2-A9, 2006

20 Κύρια είδη καρβαπενεμασών
Ενζυμα τύπου VIM, IMP, GIM, SPM Μεταλλοένζυμα, υδρολύουν πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, κεφαμυκίνες, καρβαπενέμες, δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη B) Ενζυμα τύπου KPC Ένζυμα σερίνης, υδρολύουν πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, κεφαμυκίνες, καρβαπενέμες, αναστέλλονται από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη Α) Ορισμένα ένζυμα τύπου OXA ((23-27, 40, 48) Ένζυμα σερίνης, υδρολύουν πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, κεφαμυκίνες, καρβαπενέμες, αναστέλλονται σε μικρό βαθμό από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη D)

21 Έλεγχος MBL – Βασικές αρχές
Χρησιμοποιείται ένας αναστολέας του ενζύμου (EDTA) σε συνδυασμό με καρβαπενέμη ή/και κεφταζιδίμη Το EDTA αναστέλλει την καρβαπενεμάση και ελαττώνει το επίπεδο αντοχής στην καρβαπενέμη

22 Έλεγχος MBL – Τεχνικές Μέθοδος 1 Μέθοδος 2
Τοποθέτηση δισκίου Imp (10 μg) δίπλα (20 mm) σε κενό δισκίο στο οποίο ενσταλάζεται 10 μl διάλυμα EDTA 0,5M Η διάχυση του EDTA αναστέλλει την έκκριση MBL και δημιουργείται κενό στην βακτηριακή ανάπτυξη ανάμεσα στα δύο δισκία Μέθοδος 2 Τοποθέτηση δύο δισκίων Imp (10 μg), στο ένα εκ’ των οποίων ενσταλάζεται 10 μl διάλυμα EDTA 0,5M Σύγκριση των διαμέτρων αναστολής (διαφορά 5 mm???) Προσοχή: καμία μέθοδος δεν είναι προτυποποιημένη

23 K. pneumoniae VIM1 (+)

24

25 Έλεγχος MBL – Αναφορά Αντοχή σε όλες τα β-λακταμικά, ανεξάρτητα του αντιβιογράμματος, εκτός της αζτρεονάμης Για την αζτρεονάμη, αναφορά ανάλογα του αντιβιογράμματος, μετά από επιβεβαίωση ότι το στέλεχος είναι ESBL(-).

26 Έλεγχος MBL – Αναφορά Ενδιαφέρει το επίπεδο αντοχής στις καρβαπενέμες στα MBL(+) στελέχη? Στελέχη με MIC 2-8 mg/L μπορεί να απαντήσουν στην θεραπεία με ιμιπενέμη, ανάλογα όμως την περιοχή της λοίμωξης Στελέχη με MIC ≥ 16 mg/L δεν φαίνεται να απαντούν στην θεραπεία με ιμιπενέμη Είναι “σωστή” η υπέρ-διόρθωση του αντιβιογράμματος? Μπορεί να υπάρξει προτυποποιημένος τρόπος διαχωρισμού παρομοίων στελεχών?

27 Κύρια είδη AmpC λακταμασών
Ενζυμα τύπου AAC, ACT, CFE, CMY, FOX, LAT, MIR, MOX Υδρολύουν πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, κεφαμυκίνες, δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό (Ampler τάξη C)

28 Έλεγχος AmpC – Βασικές αρχές
Αρχική διαλογή με βάση την μειωμένη ευαισθησία ή την αντοχή στην κεφοξιτίνη Χρήση αναστολέα APB (3-αμινο-φενυλ-βορονικό οξύ) σε συνδυασμό με κεφταζιδίμη ή/και κεφοξιτίνη Το APB αναστέλλει την AmpC λακταμάση και ελαττώνει το επίπεδο αντοχής στην κεφοξιτίνη ή την κεφταζιδίμη Πρόβλημα όταν η αντοχή στην κεφοξιτίνη προέρχεται από απώλεια πορίνης και όχι από παραγωγή AmpC λακταμάσης

29 E. cloacae AmpC (+)

30 Έλεγχος AmpC – Αναφορά Δεν υπάρχει οδηγία για αλλαγή του αντιβιογράμματος ανάλογα με τα αποτελέσματα του ελέγχου Η θεραπεία στελεχών AmpC(+) με κεφαλοσπορίνες μπορεί να οδηγήσει σε επιλογή μεταλλακτών ανθεκτικών στις κεφαλοσπορίνες γ’ γενεάς

31 Πρόταση ταυτόχρονης διερεύνησης ESBL, AmpC και MBL σε στελέχη E
Πρόταση ταυτόχρονης διερεύνησης ESBL, AmpC και MBL σε στελέχη E. coli και K. pneumoniae GA Jacoby et al., J Clin Microbiol, 2006

32 Ειδικά προβλήματα Enterobacter, Citrobacter, Serratia spp.
Παραγωγή ιδιοσυστασιακών AmpC β-λακταμασών Εξ’ ορισμού αντοχή: αμπικιλλίνη, αμοξυκιλλίνη, αμοξυκιλλίνη+κλαβ., κεφαλοσπορίνες Α’ γενεάς, κεφοξιτίνη Θεραπεία με κεφαλοσπορίνες Γ’ γενεάς  πολύ πιθανή η επιλογή μεταλλακτών με υπερπαραγωγή AmpC  αντοχή τικαρκιλλίνη, πιπερακιλλίνη, κεφαλοσπορίνες Γ’ γενεάς Το κλαβουλανικό επίσης δρα σαν επαγωγέας (Παράδοξο φαινόμενο: Tic Ευαίσθητο – Tcc Ανθεκτικό) Η κεφεπίμη δραστική, εφόσον το στέλεχος είναι ESBL(-) Επιβάλλεται επαναληπτικός έλεγχος σε μεσοδιαστήματα 3-4 ημέρων κατά την διάρκεια της θεραπείας

33 Ειδικά προβλήματα - Klebsiella
Παραγωγή χρωμοσωματικών β-λακταμασών Εξ’ ορισμού αντοχή: αμπικιλλίνη, αμοξυκιλλίνη

34 Κινολόνες στην θεραπευτική

35 Αντοχή στις κινολόνες Χρωμοσωμιακή, μη μεταβιβαζόμενη, μέσω σημειακών μεταλλαγών στα ένζυμα DNA γυράση και τοποϊσομεράση IV Χρωμοσωμιακή, μη μεταβιβαζόμενη, μέσω αντλίας ενεργούς εξώθησης (efflux pumps) Χρωμοσωμιακή, μη μεταβιβαζόμενη μέσω ανεπάρκειας πορινών Πλασμιδιακή, μεταβιβαζόμενη, μέσω της ομάδας γονιδίων qnr, που αναστέλλουν την σύνδεση της κινολόνης στην DNA γυράση Προσοχή: οι κινολόνες έχουν κοινό μηχανισμό δράσης και η αντοχή είναι διασταυρούμενη

36 Σημειακές μεταλλαγές γονιδίων gyr - par
KL Hopkins et al., Intern J Antimicrob Agents, 2005

37 Κινολόνες – Έλέγχος της αντοχής
Το επίπεδο της αντοχής εξαρτάται από τον αριθμό των μεταλλαγών και το γονίδιο που επηρεάζεται Μια μεταλλαγή σε ένα γονίδιο συνήθως οδηγεί σε μειωμένη ευαισθησία  προθάλαμος στην πλήρη αντοχή Δύο ή περισσότερες μεταλλαγές σε ένα γονίδιο οδηγούν σε πλήρη αντοχή Δύο ή περισσότερες μεταλλαγές σε πολλαπλά γονίδια οδηγούν σε υψηλού επιπέδου αντοχή

38 Κινολόνες – Έλέγχος της αντοχής
Στα εντεροβακτηριακά η αντοχή στην σιπροφλοξασίνη είναι επαρκής για την πρόβλεψη της αντοχής όλης της ομάδας (συμπεριλαμβανομένων των “ευρέως φάσματος” μοξιφλοξασίνη και λεβοφλοξασίνη) Το ναλιδιξικό οξύ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της πρώτης μεταλλαγής CipS-NalR  “πιθανή αποτυχία θεραπείας με φθοριοκινολόνες”

39 Κινολόνες – Εντόπιση της πρώτης μεταλλαγής
MPC (Mutation Prevention Concentration) YT Chen et al., Antimicrob Agents Chemother, 2006

40 Πλασμιδιακή αντοχή στις κινολόνες
YT Chen et al., Antimicrob Agents Chemother, 2006

41 Φυλογενετικό δένδρο κυριότερων ανατύπων γονιδίων τύπου qnr
Δομή πλασμιδίου pK245 YT Chen et al., Antimicrob Agents Chemother, 2006

42 Αντοχή στις αμινογλυκοσίδες
Ενεργής απέκκριση μέσω αντλιών (E. coli) Μεθυλίωση του γονιδίου του 16S rRNA (Klebsiella – Serratia) Έκκριση μετατρεπτικών ενζύμων (όλα τα εντεροβακτηριακά) Αδενυλο-τρανσφεράσες Ακετυλο-τρανσφεράσες Φωσφο-τρανσφεράσες

43 Αμινογλυκοσίδες – Περίεργοι φαινότυποι
Αμικασίνη  χρήση σε εντεροβακτηριακά GenR Όμως περίεργοι φαινότυποι είναι υπαρκτοί

44 Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας
(Β) Έλεγχος και επιλεκτική αναφορά Πιπερακιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Τικαρκιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Αμοξυκιλλίνη+κλαβ. ή αμπικιλλίνη+σουλμπ. Πιπερακιλλίνη+ταζομπακτάμη Τικαρκιλλίνη+κλαβουλανικό Κεφοξιτίνη Κεφοταξίμη ή κεφτριαξόνη Κεφταζιδίμη Κεφεπίμη Αζτρεονάμη Ιμιπενέμη ή μεροπενέμη Ερταπενέμη Σιπροφλοξασίνη ή λεβοφλοξασίνη Κο-τριμοξαζόλη Αμικασίνη Νετιλμικίνη Τομπραμυκίνη Τετρακυκλίνη Χλωραμφαινικόλη (Α) Έλεγχος και αναφορά Αμπικιλλίνη Κεφαζολίνη Κεφουροξίμη Γενταμικίνη (Ο) Επιπλέον για τα ούρα Ναλιδιξικό οξύ Νορφλοξασίνη ή οφλοξασίνη Νιτροφουράνια Κο-τριμοξαζόλη

45 Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας Ειδικές περιπτώσεις
Salmonella – Shigella από κόπρανα Αμπικιλλίνη Σιπροφλοξασίνη Κο-τριμοξαζόλη Salmonella – Shigella από εξωεντερικές πηγές Ναλιδιξικό οξύ Κεφταζιδίμη ή κεφτριαξόνη Χλωραμφαινικόλη Οι κεφαλοσπορίνες Α’ και Β’ γενεάς, οι κεφαμυκίνες και οι αμινογλυκοσίδες δεν είναι δραστικές in vivo (δεν ελέγχονται)

46 Η αποστολή του κλινικού μικροβιολόγου
Χ 20 mm