Tehnike u čijoj je osnovi interakcija antigen-antitelo

Παρουσίαση με θέμα: "Tehnike u čijoj je osnovi interakcija antigen-antitelo"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Tehnike u čijoj je osnovi interakcija antigen-antitelo

2 A. Faktori koji utiču na merenje antigen-antitelo reakcije
B. Testovi Aglutinacije 1. Aglutinacija/Hemaglutinacija a. Kvalitativni test aglutinacije b. Kvantitativni test aglutinacije c. Primena testa aglutinacije 2. Pasivna hemaglutinacija 3. Coomb's Test (Antiglobulinski test) a. Direktan Coomb's Test b. Indirektan Coomb's Test c. Primena 4. Inhibicija Hemaglutinacije

3 C. Testovi Precipitacije
1. Radijalna Imunodifuzija (Mancini) 2. Imunoelektroforeza 3. Protiv strujna elektroforeza D. Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kompetitivna RIA/ELISA za detekciju Ag 2. Nekompetitivna RIA/ELISA za Ag ili At E. Testovi za ćelijske antigene 1. Imunofluorescenca a. Direktna Imunofluorescenca b. Indirektna Imunofluorescenca c. Protočna citofluorimetrija F. Fiksacija komplementa

4 Tip reakcije antigena i antitela zavisi od prirode antigena
Solubilni antigen – imunoprecipitacija Partikularni antigen – imunoaglutinacija

5 Imunoprecipitacija Brz i senzitivan test za detekciju proteina/Ag posebno onih koji su prisutni u maloj koncentraciji

6 Imunotestovi sa obeleženim antigenom ili antitelom
Radioimunotestovi (RIA) Enzimimunotestovi (ELISA) Imunohistohemijske tehnike formiranje velikih nesolubilnih imunskih kompleksa nije neophodno

7 Testovi za ćelijske antigene
formiranje velikih nesolubilnih imunskih kompleksa nije neophodno

8 Imunohistohemijske tehnike
Imunoenzimske tehnike Tehnika imunoperoksidaznog bojenje Tehnika bojenja alkalnom fosfatazom Imunoflorescenca Direktna Indirektna Protočna citofluorimetrija

9 Metode bazirane na komplementu
formiranje velikih nesolubilnih imunskih kompleksa nije neophodno

10 Test fiksacije komplementa
Koriste se eritrociti ovce, anti-eritrocitna At i komplement, plus specifičan antigen (ukoliko se ispituje At u serumu) ili specifično At (ukoliko se ispituje Ag u serumu).

11 Test fiksacije komplementa
1. ako je At ili Ag prisutan u serumu pacijenta, onda je komplement potpuno iskorišćen tako da eritorciti nisu lizirani. 2. ako At ili Ag nisu prisutni onda komplement nije iskorišćen tako da se vezuje za anti-eritrocitna At i dovodi do lize eritrocita. Koristi se za dokazivanje infekcije Treponema pallidum Wassermann-ov test je jedna forma testa fiksacije komplementa. Ag(kardiolipin) nema Ag Ag Y serum pacijenta sa inaktivisanim komplementom Ag Y

12 I) Imunoglobulini i drugi serumski proteini
Abnormalnosti serumskih imunoglobulina pojavljuju se u autoimunskim infektivnim imunodeficijentnim i limfoproliferativnim poremećajima Kvalitativne, kvantitativne i funkcionalne procene serumskih imunoglobulina

13 Testovi za procenu humoralnog imuniteta u kliničkoj praksi
Mehanizmi molekulskih interakcija značajne za ostvarivanje funkcija humoralnog imunskog odgovora: kvantitativno određivanje koncentracija imunološka identifikacija karakterizacija Određivanje ukupnih proteina Biuretska, tanin turbidimetrijska, metoda taloženja trihlorsirćetnom kiselinom i dr Elektroforetske tehnike Metoda po Grabar-Williams-u ili mikrozonska elektroforeza po Shidigger-u, na acetatnoj celulozi ili agaroznom gelu

14 Serumske elektorforeze (jednostavna, jeftina, brza tehnika) obezbeđuje informacije o povećanju i smanjenju ukupnih serumskih imunoglobulina i prisustvu monoklonskih traka

15 Karakterizacija – imunofiksacija
Kvantifikacija klasa imunoglobulina – nefelometrija Funkcionalna aktivnost – merenje izoaglutinina (IgM)

16 Zonska elektroforeza (semikvantitativna)

17 Karakterizacija paraproteina (patološki proteini) – imunoelektroforeza i imunofiksacija
Kvantifikacija paraproteina – kvantifikacijom imunoglobulina, denzitometrijom (Bence-Jones proteini)

18 Kvantifikacija imunoglobulina i drugih proteina
Radijalna imunodifuzija (RID) Nefelometrija Kvantifikacija IgG klasa RID, ELISA, nefelometrija

19 II) Komplement i imunski kompleksi
Rekurentne bakterijske infekcije Autoimunske bolesti sa prominentnim imunski kompleks interakcijama Test titracije komplementa (hemolitički test-CH50/100) C3, C4 i properdin kvantifikacija C3 nefrotski faktor C1 esteraze inhibitor C1q vezujući metod za imunske komplekse cirkulišući imunski kompleksi

20 III) Autoimunska serologija
Autoantitela u tkivima ili serumu

21 AUTOANTITELA * prisustvo autoantitela je uobičajeno povazano sa imunopotologijom * intezitet oštećenja je povezana sa količinom autoantitela * autoantitela su najčešće specifična za imunodominantne epitope

22 Indirektna imunofluorescenca (ANA, tkivna autoantitela i anti-neutrofilna citoplazmatska antitetla-ANCA) Aglutinacija (tiroidna antitela, RF) Imunoprecipitacija (ENA-antitela specifična za ekstraktabilni nuklearni antigen, antitela specifična za ds DNK i nuklearne antigene) RIA (anti-ds DNK antitela) i ELISA

23 FLUOROHROM - KONJUGOVAN
DETEKCIJA AUTOANTITELA INDIREKTNOM IMUNOFLUORESCENCOM POZITIVAN REZULTAT (AUTO At+) NEGATIVAN REZULTAT (AUTO At-) EMISIJA SVETLOSTI (FITC  ZELENA) UV ZRACI UV ZRACI NEMA EMISIJE FLUOROHROM - KONJUGOVAN ANTISERUM ZA HUMANI Ig ISPIRANJE ISPIRANJE Y nema SERUM (AUTO At) ISPIRANJE Y AUTO Ag nema ISPIRANJE ĆELIJE STAKLO

24 Indirektna imunofluorescenca
ANCA-Wegener-ova granulamatoza Antitela specifična za ACH receptor (Miastenija gravis) ANA – sistemske reumatske bolesti (SLE, polimozitis, skleroderma, Sjogren-ov sindrom), reakcije na lekove, hronične infekcije, RA i druge autoimunske bolesti Anti-fosfolipidna antitela – anti-fosfolipidni sindrom RF (IgM, IgA ili IgG)

25 Problemi: * zdrave osobe sa prisutnim autoantitelima * Osobe sa manifestacijama imunopatoloških bolesti, kod kojih očekivana autoantitela nisu detektabilna * nizak nivo autoantitela (IgM) može da bude u vezi sa infekcijom * krosreaktivnost

26 IV) Fenotipizacija ćelija i funkcionalni testovi
Imunski sistem je kontrolisan velikim brojem ćelija i u dobro balansiranom imunskom sistemu ove ćelije međusobno efikasno interaguju U imunskim bolestima taj odnos je poremećen Identifikacija ćelija – fenotipska analiza Određivanje njihove funkcije ili funkcionalnog potencijala – in vitro funkcionalni testovi

27 V) Citokini, inflamatorni pokazatelji i tumorski markeri
Citokini i solubilni citokinski receptori ELISA ELISA spot Merenje mRNK Inflamatorni pokazatelji Serumska elektroforeza CRP - nefelometrija SE Kvantifikacija serumskog β2-mikroglobulina (RID, ELISA) Tumorski markeri RIA, ELISA, imunofluorescenca (tkiva)

28 VI) Imunohistologija Za identifikaciju ćelijskih antigena i produkata na presecima tkiva Svetlosni, elektronski ili florescentni mikroskop Direktna Indirektna Pozitivne i negativne kontrole

29 VII) Alergije i hipersenzitivnost
Reakcije preosetljivosti Tip I ukupni IgE (RIST) alergen specifični IgE (RAST) in vivo intradermalni test Reakcije preosetljivosti Tip II Coombs-ov test Reakcije preosetljivosti Tip III Autoantitela Reakcije preosetljivosti Tip IV Mantoux kožni test Funkcije T ćelija – proliferacija i produkcija citokina