Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD Ιανουαρίου 2018

Παρουσίαση με θέμα: "Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD Ιανουαρίου 2018"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD 10-11 Ιανουαρίου 2018
Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας – Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Εργαστήριο Τεχνολογίας Οργάνων Μικροσκόπια Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD 10-11 Ιανουαρίου 2018

2 Είδη Μικροσκοπίας Φθορισμού Ηλεκτρονικό Φωτονικό

3

4 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Η πρώτη σύνθετη κατασκευή αποδίδεται στους Ολλανδούς Hans and Zacharias Janssen, Χανς και Ζακαρίας Γιάνσεν, το Επετύγχανε μεγέθυνση 20 φορές. Αποτελούνταν από 2 φακούς, έναν προσοφθάλμιο, και έναν αντικειμενικό φακό κοντά στο αντικείμενο προς παρατήρηση.

5 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Το 17ο αιώνα χρησιμοποιήθηκε συστηματικά από τον Φυσικό Robert Hooke, ο οποίος δημοσίευσε το έργο Micrographia (1665), με εικόνες γνωστών αντικειμένων και εντόμων σε μικροσκοπική κλίμακα. Εισήγαγε για πρώτη φορά την ονομασία‟cells” (κελιά) για να περιγράψει δομές που παρατηρούσε σε τομές φελλού, με μεγέθυνση 30 φορές. Θεωρούνταν ως μικροί αγωγοί μεταφοράς υγρών στα φυτά. Μετά από 2 αιώνες αυτές οι δομές αναγνωρίστηκαν ως κύτταρα, δηλαδή οι βασικές μονάδες της ζωής.

6 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Ο Antoni van Leeuwenhoek την περίοδο , ένας Ολλανδός έμπορος και ερασιτέχνης ερευνητής, κατασκεύασε το δικό του μικροσκόπιο. Αποτελούνταν από έναν φακό, πολύ βελτιωμένο που επετύγχανε μεγέθυνση 300 φορές. Το μικροσκόπιο Leeuwenhoek με διαστάσεις περίπου 4X9 cm Οι παρατηρήσεις του Leeuwenhoek

7 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Κατά τη διάρκεια του 17ου αιώνα πολλοί κατασκευαστές γυαλιών οράσεως, κατασκεύασαν μικροσκόπια, τα οποία αξιοποίησαν ερευνητές όπως ο Marcello Malpighi. : Βελτιώνονται σταδιακά οι φακοί μικροσκοπίων Ιστολογικές παρατηρήσεις πχ. Μαλπιγγιανά σωληνάρια στο νεφρό του ανθρώπου

8 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Το 1833 ο Robert Brown δημοσίευσε τις μικροσκοπικές του παρατηρήσεις στις ορχιδέες και περιέγραψε τον πυρήνα του κυττάρου.

9 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Το 1839 οι Theodor Schwann Matthias Schleiden διατύπωσαν την κυτταρική θεωρία: κάθε κύτταρο προέρχεται από κύτταρο. Έως αυτή την εποχή περιγραφή των παρατηρήσεων με σκίτσα. H πρώτη παρατήρηση με φωτογραφικές μεθόδους αποδίδεται στον Γάλλο Donne.

10 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Το 1876 o Ernst Abbe έδειξε πώς μπορεί να βελτιωθεί ο σχεδιασμός των μικροσκοπίων όσον αφορά την οπτική. Εφηύρε τον αποχρωματικό φακό, ένας φακός μικροσκοπίου ο οποίος εξαλείφει την παραμόρφωση χρώματος Από τις αρχές του 20ου αιώνα το απλό και πρωτόγονο μικροσκόπιο με το μοναδικό φακό, εξελίχθηκε σε όργανο με πολλούς φακούς και πολλές δυνατότητες.

11 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Χρωστικές Ο Camillo Golgi to 1873 με ειδική χρωστική νιτρικού αργύρου αποκάλυψε τη δομή νευρικών κυττάρων. Πολλά χρόνια αργότερα αποκαλύφθηκε ότι η χρωστική του βάφει εκλεκτικά ένα κυτταρικό οργανίδιο το οποίο πήρε το όνομά του, το σύμπλεγμα Golgi. Παρατήρηση τομής ιππόκαμπου εγκεφάλου με τη χρωση Golgi

12 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου
Χρωστικές O Robert Feulgen επινόηση μια χρωστική για την παρατήρηση DNA, μέθοδος η οποία βρίσκει εφαρμογή και σήμερα. Εξαρτάται από την όξινη υδρόλυση του DNA

13 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου

14 Η ιστορία του φωτονικού μικροσκοπίου

15 Φωτονική Μικροσκοπία Ως Οπτικά ή Φωτονικά αναφέρονται τα μικροσκόπια εκείνα που χρησιμοποιούν το τμήμα του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος που είναι ορατό, δηλαδή από nm.  Το φωτονικό μικροσκόπιο δίνει τη δυνατότητα μεγέθυνσης έως και 1000 φορές και να διακρίνουμε λεπτομέρειες μεγέθους έως 0,2μm. Το οπτικό μικροσκόπιο λέγεται και σύνθετο γιατί η λειτουργία του στηρίζεται σε ένα σύστημα φακών. Η δυνατότητα διάκρισης των διάφορων κυτταρικών συστατικών στηρίζεται στην ικανότητα απορρόφησης ή διάθλασης του φωτός

16 Διάθλαση-Ανάκλαση Όταν μία φωτεινή δέσμη, που διαδίδεται σε ένα μέσο, συναντήσει τη διαχωριστική επιφάνεια που χωρίζει το αρχικό μέσο διάδοσης από ένα άλλο οπτικό μέσο, τότε ένα μέρος της ανακλάται προς το αρχικό μέσο διάδοσης, ενώ ένα άλλο μέρος συνεχίζει να διαδίδεται στο δεύτερο μέσο. Στο σχήμα βλέπουμε πώς ανακλώνται οι ακτίνες, όταν προσπίπτουν σε μια λεία επιφάνεια, για παράδειγμα από τον αέρα στην επιφάνεια ενός γυαλιού. Η προσπίπτουσα και η ανακλώμενη ακτίνα σχηματίζουν, στο σημείο ανάκλασης, γωνίες θπ και θα, αντίστοιχα, με την κάθετο προς την ανακλώσα επιφάνεια. Πειραματικά αποδεικνύεται ότι θπ=θα. Οι ακτίνες που εισέρχονται στο γυαλί αλλάζουν διεύθυνση διάδοσης. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται διάθλαση

17 Είδη Φωτονικού Μικροσκοπίου
Ανάλογα με τη διάταξη των φακών και τον τρόπο παρατήρησης τα οπτικά μικροσκόπια διακρίνονται σε: φωτεινού πεδίου, σκοτεινού πεδίου, αντίθεσης φάσεως Πολώσεως Φθορισμού

18 Δομικά μέρη οπτικού μικροσκοπίου

19 Παραλλαγές φωτονικού μικροσκοπίου
α. Κοινό οπτικό μικροσκόπιο χωρίς χρώση (φωτεινού πεδίου) β. Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων. γ. Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων-συμβολής δ. Μικροσκόπιο φθορισμού

20 Παραλλαγές φωτονικού μικροσκοπίου
Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου: η εικόνα που παρατηρούμε είναι ένα φωτεινό αντικείμενο σε σκοτεινό πεδίο.

21 Διάγραμμα των φακών και πορείας των φωτεινών ακτίνων στο οπτικό μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου.

22 Φακοί

23 Φωτεινή πηγή-Συγκεντρωτής φακός
Λυχνίες: Βολφραμίου Αλογόνου Βολφραμίου-Αλογόνου Υδραργύρου (για μικροσκόπια φθορισμού) Συγκεντρωτής φακός: Λειτουργία: Φωτισμός του δείγματος και παραγωγή αντίθεσης Το φως συγκλίνει σχηματίζοντας έναν κώνο πάνω στο δείγμα Στη συνέχεια δημιουργείται ένας ανάστροφος κώνος που καταλήγει στον αντικειμενικό φακό Το διάφραγμα ρυθμίζει το μέγεθος του κώνου

24 Αντικειμενικοί φακοί Λειτουργία: Σχηματισμός πρώτου ειδώλου
Οι αντικειμενικοί φακοί βρίσκονται κοντά στο δείγμα και δημιουργούν την πρώτη μεγεθυμένη εικόνα Οι αντικειμενικοί φακοί που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι 10Χ, 20Χ, 40Χ, και 100Χ. Στον φακό 100Χ χρησιμοποιείται μια σταγόνα ελαίου πάνω στο δείγμα για αύξηση του δείκτη διάθλασης ώστε να επιτευχθεί καλύτερη διακριτική ικανότητα.

25 Προσοφθάλμιος φακός Λειτουργία: Μεγέθυνση του ειδώλου που έρχεται από τον αντικειμενικό φακό. Οι προσοφθάλμιοι φακοί που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι 5Χ, 10Χ, και 20Χ.

26 Μεγέθυνση μικροσκοπίου
Υπολογίζεται από το γινόμενο της μεγέθυνσης του προσοφθάλμιου φακό επί της μεγέθυνσης του αντικειμενικού φακού.

27 Διακριτικό όριο-Διακριτική ικανότητα
Ως διακριτικό όριο(δ) ορίζεται ως η μικρότερη απόσταση δύο σημείων του αντικειμένου τα οποία μπορεί ο παρατηρητής να τα διακρίνει ως ξεχωριστά σημεία. Δίνεται από τον τύπο: δ=0,61*λ/ΑΑ Όπου: δ=διακριτικό όριο λ=μήκος κύματος της ακτινοβολίας που χρησιμοποιείται ΑΑ= το αριθμητικό άνοιγμα Το διακριτικό όριο του οπτικού μικροσκοπίου είναι από ,2μm Η διακριτική ικανότητα = 1/δ αυξάνεται όσο μειώνεται το διακριτικό όριο.

28 Από τι εξαρτάται η διακριτική ικανότητα;
Εξαρτάται από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας και από το δείκτη διάθλασης του μέσου που παρεμβάλλεται μεταξύ φακού και αντικειμένου Άρα βελτίωση της διακριτικής ικανότητας έχουμε με δύο τρόπους: Αύξηση του δείκτη διάθλασης Ελάττωση του μήκους κύματος Δίνεται από τον τύπο: δ=0,61*λ/ΑΑ Όπου: δ=διακριτικό όριο λ=μήκος κύματος της ακτινοβολίας που χρησιμοποιείται ΑΑ= το αριθμητικό άνοιγμα

29 Δείκτης διάθλασης για τον αέρα n=1 και για το υλικό των φακών n=1.512
Επειδή η ταχύτητα του φωτός μέσα σε ένα υλικό είναι πάντα μικρότερη από την ταχύτητά του στο κενό, από τον ορισμό προκύπτει ότι ο δείκτης διάθλασης για οποιοδήποτε υλικό είναι πάντα μεγαλύτερος από τη μονάδα για τον αέρα n=1 και για το υλικό των φακών n=1.512 Στο μικροσκόπιο αύξηση του δείκτη διάθλασης επιτυγχάνεται με την παρεμβολή ελαίου που έχει n=1.5 μεταξύ παρασκευάσματος και αντικειμενικού φακού για αύξηση της διακριτικής ικανότητας. Αυτό μόνο για φακούς μεγάλης μεγέθυνσης (100Χ).

30 ορίζεται ως το γινόμενο:
Αριθμητικό άνοιγμα Το αριθμητικό άνοιγμα χαρακτηρίζει τη μέγιστη γωνία με την οποία ο αντικειμενικός φακός μπορεί να δεχτεί φως από το παρασκεύασμα ορίζεται ως το γινόμενο: ΑΑ= n*ημ φ/2 Όπου n είναι ο δείκτης διάθλασης του μέσου που παρεμβάλλεται μεταξύ αντικειμένου και αντικειμενικού φακού (για τον αέρα n=1 και για το υλικό των φακών n=1.512), και φ η γωνία με την οποία φαίνεται ο φακός από το αντικείμενο.

31 Μικροσκοπία φθορισμού

32 Τεχνικές μικροσκοπίας φθορισμού

33 Τεχνικές μικροσκοπίας φθορισμού

34 Στη μικροσκοπία φθορισμού τα μακρομόρια του κυττάρου (πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα) σημαίνονται με φθορίζουσες χρωστικές και παρατηρούνται ως διαφορετικά χρώματα στο μικροσκόπιο φθορισμού.

35 Προετοιμασία δείγματος για παρατήρηση στο μικροσκόπιο φθορισμού
Μονιμοποίηση δείγματος: Ακινητοποίηση όλων των κυτταρικών διεργασιών και οργανιδίων και σταθεροποίηση δείγματος (πχ κυττάρων) σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Μέσα μονιμοποίησης είναι φορμαλδεϋδη, παραφολμαδεϋδη Επώαση με ήπιο απορρυπαντικό ώστε να γίνει παροδικά διαπερατή η κυτταρική μεμβράνη για να εισέλθουν το κατάλληλα πρωτογενή και δευτερογενή αντίσωμα. Νεκρά κύτταρα

36 Μεθοδολογία μικροσκοπίας φθορισμού
Δευτερογενές αντίσωμα Πρωτογενές αντίσωμα

37 Πώς μπορούμε να παρατηρήσουμε ζωντανά κύτταρα σε μικροσκόπιο φθορισμού

38 GFP DAPI - MTD wt MTD SA MTD IA/SA MTD IA

39 Δομικά μέρη μικροσκοπίου φθορισμού
Το μικροσκόπιο φθορισμού μοιάζει με ένα συνηθισμένο φωτονικό μικροσκόπιο, με εξαίρεση το γεγονός ότι το φως διέρχεται από δύο είδη φίλτρων. Φίλτρο διέγερσης: επιτρέπει να διέλθουν μόνο τα μήκη κύματος που διεγείρουν τη συγκεκριμένη χρωστική. Στη συνέχεια μέσω κατόπτρου προσπίπτει πάνω στο παρασκεύασμα Φίλτρο φραγμού: αφήνει να διέλθουν μόνο τα μήκη κύματος που εκπέμπονται από τη φθορίζουσα χρωστική.

40 Μικροσκόπιο φθορισμού

41 Συνεστιακό μικροσκόπιο
Εξειδικευμένος τύπος μικροσκοπίου φθορισμού Λήψη εικόνων σε τομές οπότε τελικά δημιουργείται μια τρισδιάστατη εικόνα του δείγματος. Η δέσμη laser εστιάζει σε ένα σημείο του δείγματος κι ένα άνοιγμα στον ανιχνευτή επιτρέπει να συμπεριληφθεί στην εικόνα μόνο ο φθορισμός που εκπέμπεται από το συγκεκριμένο σημείο.

42 Σύγκριση μικροσκοπίων φθορισμού

43 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
Η ακτινοβολία που χρησιμοποιείται είναι επιταχυμένα ηλεκτρόνια. Δύο τύποι: Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης Δυνατότητα μεγέθυνσης έως και φορές και έχει διακριτικό όριο 2nm.

44 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης
Κύρια δομικά μέρη: Πηγή ηλεκτρονίων ένα σύστημα ανόδου καθόδου όπου εφαρμόζεται υψηλή τάση, για την επιτάχυνση των ηλεκτρονίων Συμπυκνωτές φακοί: εστίαση της δέσμης στο παρασκεύασμα Αντικειμενικός φακός: εστίαση της εικόνας στην οθόνη Φακός προβολής: ρύθμιση της μεγέθυνσης

45 Τα σημεία του παρασκευάσματος που δεν είναι διαπερατά από τα ηλεκτρόνια, μας δίνουν σκοτεινές περιοχές ενώ αντίθετα τα διαπερατά σημεία δίνουν φωτεινές περιοχές.  Αυτή η διαφοροποίηση επιτυγχάνεται με την εκλεκτική «χρώση» του παρασκευάσματος

46 Προετοιμασία δείγματος για παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
Ένα βιολογικό δείγμα για να αποκτήσει τις πιο πάνω ιδιότητες θα πρέπει να υποβληθεί στην πιο κάτω διαδικασία: α.  Μονιμοποίηση.  Έχει ως σκοπό την ακινητοποίηση (νέκρωση) όλων των διαδικασιών του κυττάρου και μπορεί να επιτευχθεί με χημικούς και φυσικούς τρόπους.  Οι χημικοί τρόποι, περιλαμβάνουν επεξεργασία του δείγματος με ουσίες όπως οι αλδεΰδες (φορμαλδεΰδη HCHO, παραφορμαλδεΰδη,) ή άλλες ουσίες όπως η ακρολεΐνη, το τετροξείδιο του οσμίου OsO4, το υπερμαγγανικό κάλιο KMnO4, κ.ά. διαλυμένα σε κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα (φωσφορικά, κακοδυλικό νάτριο, veronal acetate, PIPES κλπ.) των οποίων η συγκέντρωση και το pH πρέπει να είναι ρυθμισμένα με μεγάλη ακρίβεια.  Οι φυσικοί τρόποι μονιμοποίησης χρησιμοποιούν γρήγορη ψύξη του δείγματος, συνήθως με υγρό Ν2.  Αυτές οι μέθοδοι είναι ιδιαίτερα χρήσιμες σε περιπτώσεις όπου χρειάζεται να διατηρηθεί η δραστικότητα ουσιών όπως τα νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA) ή οι πρωτεΐνες (ένζυμα).  β. Αφυδάτωση.  Σ' αυτό το στάδιο γίνεται αντικατάσταση του νερού του μονιμοποιημένου δείγματος με αιθυλική αλκοόλη ή ακετόνη

47 Προετοιμασία δείγματος για παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
γ. Εμπότιση - έγκλειση.  Για να μπορέσει να κοπεί ένα βιολογικό παρασκεύασμα σε λεπτές τομές θα πρέπει το μέσο αφυδάτωσης ν' αντικατασταθεί με το μέσο έγκλεισης.  Τα μέσα έγκλεισης είναι συνήθως εποξικές ή άλλες ρητίνες (παραφίνη). δ. Τμήση τομών Τα δείγματα κατόπιν κόβονται σε πολύ λεπτές τομές, πάχους nm, με τον υπερμικροτόμο, και τοποθετούνται πάνω σε ειδικά πλέγματα, (grids, αντίστοιχα με τις αντικειμενοφόρους πλάκες) που τοποθετούνται στο ΗΜΔ.

48 Προετοιμασία δείγματος για παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
ε. Χρώση.  Συνήθως τα βιολογικά δείγματα είναι τελείως διαπερατά από τα ηλεκτρόνια γιατί τα στοιχεία από τα οποία αποτελούνται (συνήθως C, H, O και N) είναι πολύ ελαφριά για να σκεδάσουν τα επιταχυνμένα ηλεκτρόνια και να δώσουν την απαιτούμενη αντίθεση (contrast).  Για  το λόγο αυτό χρειάζεται να τα «χρωματίσουμε» με χημικές ουσίες που δεσμεύονται εκλεκτικά από τα διάφορα συστατικά του κυττάρου, με αποτέλεσμα τη διαφορική σκέδαση των ηλεκτρονίων και το σχηματισμό της εικόνας.  Οι πιο συνηθισμένες χρωστικές για τη χρώση τομών είναι το οξικό ουρανύλιο, ο κιτρικός μόλυβδος και το υπερμαγγανικό κάλιο.

49 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης

50 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης
Το ΗΜΣ χρησιμοποιεί, όπως και το ΗΜΔ, μια δέσμη ηλεκτρονίων που εδώ όμως αντί να διαπερνούν το παρασκεύασμα, σαρώνουν την επιφάνειά του με πολύ μεγάλη ταχύτητα.  Η δέσμη των ηλεκτρονίων παράγεται και εδώ από ένα νήμα, και ένα σύστημα ανόδου καθόδου όπου εφαρμόζεται υψηλή τάση, για την επιτάχυνση των ηλεκτρονίων  Η δέσμη των ηλεκτρονίων αφού εστιαστεί από  σύστημα  συγκεντρωτών  φακών βομβαρδίζει το παρασκεύασμα με αποτέλεσμα κάποια από τα ηλεκτρόνια να το διαπερνούν, κάποια να σκεδάζονται ή να άγονται ενώ συγχρόνως να προκαλείται η παραγωγή δευτερογενών ηλεκτρονίων, ακτίνων Χ. Τα δευτερογενή ηλεκτρόνια, που προέρχονται από την επιφάνεια του παρασκευάσματος συλλέγονται και στέλνονται σαν ένα ηλεκτρονικό σήμα μέσω ενός ενισχυτή εικόνας σ’ ένα καθοδικό σωλήνα όπου γίνεται και η παρατήρηση ή και η φωτογράφηση του δείγματος.  Στα σύγχρονα ΗΜΣ το αναλογικό ψηφιακό σήμα ψηφιοποιείται και η παρατήρηση, αλλά και όλος ο έλεγχος και η λειτουργία του μικροσκοπίου,  γίνονται μέσω Η/Υ. 

51 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο
διέλευσης Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης

52 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης