ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Παρουσίαση με θέμα: "ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
1973 ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΧΡΗΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ως οχημάτων μεταφοράς DNA ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ οδήγησε στη λήψη μεγάλων ποσοτήτων DNA που διευκόλυνε τη μελέτη του.

2 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA
Βοηθούν και στη μελέτη των πρωτεινών καθώς επιτρέπουν – μέσω κλωνοποίησης και έκφρασης των γονιδίων – τη λήψη μεγάλων ποσοτήτων από αυτές.

3 ΚΥΡΙΩΤΕΡΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Μ. Β.
ΚΥΡΙΩΤΕΡΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Μ. Β. ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ Τέμνουν το DNA ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ - ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΩΝ DNA Ένα κομμάτι του DNA μετά την είσοδό του σε πλασμίδιο ή ιό, μπορεί να εισαχθεί σε οργανισμό (προκαρυωτικό ή ευκαρυωτικό) να πολλαπλασιαστεί σε μεγάλο βαθμό, να εξαχθεί και να μελετηθεί.

4 ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ
Μας επιτρέπει να εντοπίσουμε ειδικές αλληλουχίες DNA ή RNA, χάρη στην ικανότητά τους να ‘κολλάνε΄’ σε μία συμπληρωματική τους αλληλουχία όταν ευρίσκονται σε μονόκλωνη μορφή.

5 ΣΗΜΑΝΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΤΩΝ Τμήματα DNA, συνθετικά ολιγομερή ή RNA μπορεί να σημανθούν με ραδιενεργές ή φθορίζουσες ουσίες και να χρησιμοποιηθούν ως ‘ανιχνευτές’ σε πειράματα υβριδισμού.

6 ΤΈΧΝΙΚΗ ΤΟΥ SEQUENCING
Επιτρέπει να διαβάσουμε βάση προς βάση την αλληλουχία του DNA

7 ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΟΥ SOUTHERN Το στύπωμα κατά Southern μας επιτρέπει τον έλεγχο της ακεραιότητας του DNA

8 ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ PCR
Επιτρέπει τον τοπικό πολλαπλασιασμό τμήματος DNA και τη λήψη ικανοποιητικής ποσότητας από αυτό.

9

10

11

12 Ηλεκτροφόρηση DNA

13

14

15

16 Λήψη ποσότητας DNA από κλώνο

17 Δημιουργία γενωμικής βιβλιοθήκης

18

19

20

21 Yβριδισμός νουκλεϊκών οξέων
Αρχή του υβριδισμού Υβριδοποίηση ή υβριδισμός Δημιουργία δίκλωνου από οποιαδήποτε δύο συμληρωματικά μονόκλωνα μόρια DNA ή RNA Τι είναι υβριδισμός: επαναδιάταξη αποδιάταξη 21

22 Ο υβριδισμός νουκλεϊκών οξέων είναι η βάση για αρκετές εφαρμογές:
Αποτύπωση κατά SOUTHERN Ιn situ υβριδοποίηση σε χρωμοσώματα & micro-arrays 1. Ανίχνευση τμημάτων DNA (γονιδίων, πολυμορφισμών) : Αποτύπωση κατά NORTHERN Ιn situ υβριδοποίηση & micro-arrays 2. Ανίχνευση RNA-μεταγράφων (mRNAs): 22

23 Ανίχνευση κλώνων βιβλιοθήκης

24 cDNA κλώνοι

25

26 Φορέας έκφρασης- Βιοτεχνολογία

27 DNA -Πρωτείνη

28 Σημάνσεις ανιχνευτών (ιχνηθετών)

29

30

31 ASO PROBES Allele Specific Oligonucleotide

32

33 Τεχνική διαβάσματος νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Sequencing

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45 Τεχνική αποτύπωσης κατά Southern ή Northern
Στην αποτύπωση κατά Southern ηλεκτροφορούμε & αποτυπώνουμε DNA. Ανιχνευτής: DNA Στην αποτύπωση κατά Northern ηλεκτροφορούμε & αποτυπώνουμε RNA. Ανιχνευτής: RNA (ή DNA) 45

46 Αποτύπωσης κατά SOUTHERN
Εφαρμογές Αποτύπωσης κατά SOUTHERN Ανίχνευση: Γονιδίων (έλεγχος για μεταλλάξεις) Πολυμορφισμών (προγεννητικός έλεγχος, πατρότητας, δραστών κλπ) Εφαρμογές Αποτύπωσης κατά NORTHERN ή in situ Ανίχνευση: των RNA-μεταγράφων (έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης) Οι παραπάνω εφαρμογές γίνονται πλέον και με PCR 46

47

48

49

50

51 PCR T i m e 30x Temperature Melting 94 oC Extension Annealing Primers
100 50 T i m e 30x 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’

52

53

54 DNA Replication and the Polymerase Chain Reaction

55 History The Polymerase Chain Reaction (PCR) was not a discovery, but rather an invention A special DNA polymerase (Taq) is used to make many copies of a short length of DNA (100-10,000 bp) defined by primers Kary Mullis, the inventor of PCR, was awarded the 1993 Nobel Prize in Chemistry

56 What PCR Can Do PCR can be used to make many copies of any DNA that is supplied as a template Starting with one original copy an almost infinite number of copies can be made using PCR “Amplified” fragments of DNA can be sequenced, cloned, probed or sized using electrophoresis Defective genes can be amplified to diagnose any number of illnesses Genes from pathogens can be amplified to identify them (ie. HIV) Amplified fragments can act as genetic fingerprints

57 How PCR Works PCR is an artificial way of doing DNA replication
Instead of replicating all the DNA present, only a small segment is replicated, but this small segment is replicated many times As in replication, PCR involves: Melting DNA Priming Polymerization

58 Initiation - Forming the Replication Eye
Origin of Replication 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’

59 Extension - The Replication Fork
5’ 3’ Primase Single strand binding proteins Laging Strand 3’ 5’ 5’ 3’ Okazaki fragment RNA Primers DNA Polymerase Helicase Leading Strand 5’

60 Components of a PCR Reaction
Buffer (containing Mg++) Template DNA 2 Primers that flank the fragment of DNA to be amplified dNTPs Taq DNA Polymerase (or another thermally stable DNA polymerase)

61 PCR T i m e 30x Temperature Melting 94 oC Melting 94 oC Annealing
100 50 T i m e Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

62 PCR Temperature 100 50 T i m e Melting 94 oC 5’ 3’

63 PCR Temperature 100 50 T i m e Melting 94 oC 5’ 3’ Heat 5’ 3’

64 PCR T i m e Temperature Melting Melting 94 oC 94 oC Extension
100 50 T i m e Melting 94 oC Melting 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

65 PCR T i m e Heat Heat 30x Temperature Melting 94 oC Extension
Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC Temperature 100 50 T i m e 30x 5’ 3’ Heat 5’ 5’ Heat 5’ 3’ 5’

66 DNA Between The Primers Doubles With Each Thermal Cycle
Cycles Number 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64

67 More Cycles = More DNA Number of cycles Size Marker

68

69

70

71

72 Εκκινητές για το RNA του HIV
ανίχνευση RNA-ιού με RT-PCR Απομόνωση των RNAs Όχι σήμα RNAs Εκκινητές για το RNA του HIV 72

73 Χρήση της τεχνικής PCR στην ανίχνευση πολυμορφισμών
Εφαρμογές στην Ιατροδικαστική για έλεγχο δειγμάτων & πατρότητας

74

75 Micro chips Μικροσυστοιχίες
Επιτρέπει τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων. Είτε σε διαφορετικά κύτταρα/ιστούς Είτε σε διαφορετική φάση ανάπτυξης.

76

77

78 Μικροσυστοιχίες γονιδίων _ microarrays
Δύο ειδών πλακίδια (μικροσυστοιχίες): 1] ολιγονουκλεοτιδίων (DNA chips) 25μερή νουκλεοτιδίων συντίθενται in situ στη γυάλινη επιφάνεια, με τεχνική ανάλογη της φωτο-λιθογραφίας. Μέχρι διαφορετικές αλληλουχίες που αντιπροσωπεύουν γονίδια μπορούν να συντεθούν σε επιφάνεια 1,3χ1,3 cm! 2] cDNA cDNA τμήματα (μήκους1Kb) συνδέονται με ειδικό ρομπότ στην επιφάνεια του γυαλιού. Ένα τυπικό πλακίδιο 2χ2 cm περιλαμβάνει περίπου θέσεις εμφύτευσης 78

79 Η χρήση μικροσυστοιχιών cDNA μας επιτρέπει να συγκρίνουμε μαζικά τη γονιδιακή έκφραση
Για σύγκριση δύο πληθυσμών mRNA: σήμανση με διαφορετικά φθοριοχρώματα Υβριδοποίηση με το cDNA της πλάκας Σάρωση και επεξεργασία του σήματος 79

80

81 Fluorescent In-situ Hybridisation FISH
81

82 Διαγονιδιακά ζώα