ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ Εύα Γραμουστιάνου ΜSc, PhD ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΦΑΝΕΙΕΣ.

Παρουσίαση με θέμα: "ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ Εύα Γραμουστιάνου ΜSc, PhD ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΦΑΝΕΙΕΣ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ Εύα Γραμουστιάνου ΜSc, PhD ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΦΑΝΕΙΕΣ

2 ΆΜΕΣΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Το αντιγόνο βρίσκεται πάνω στην επιφάνεια των κυττάρων -Αντιγόνα ομάδων αίματος στα ερυθρά αιμοσφαίρια -Αντιγόνα μικροβιακών κυττάρων Προσδιορισμός ομάδων αίματος Widal, Wright

3 ΈΜΜΕΣΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Το αντιγόνο προσροφάται στην επιφάνεια σωματιδίων latex κατόπιν επεξεργασίας Παρουσία αντίστοιχων αντισωμάτων ---- συγκολλώνται 1956: 1 η περιγραφή μεθόδου Ra test, Singer and Plotz + 

4 ΣΩΜΑΤΙΔΙΑ LATEX Πολυστηρένη (βακελίτης) Aποτέλεσμα πολυμερισμού Σφαιρικά σωματίδια, 0.05-2μm διάμετρο Κάθε σωματίδιο προσροφά χιλιάδες μόρια πρωτεινών Σε ποικιλία χρωμάτων

5 ‘ΕΜΜΕΣΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Αντιγόνα προσροφώνται σε σωματίδια Latex Προσθήκη αντισώματος Ένωση Ag-latex + Ab Συγκόλληση σωματιδίων Σχηματισμός κροκίδων

6 ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ - ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ 1. ΆΜΕΣΗ Αντιγόνο σωματιδιακό Ανάμιξη με ομόλογο αντίσωμα πχ εξέταση ομάδας αίματος, Widal, Wright 2. ΈΜΜΕΣΗ Ή ΠΑΘΗΤΙΚΗ Αντιγόνο προσροφημένο σε latex ή ερυθρά Ανάμιξη με ομόλογο αντίσωμα πχ RF, CRP, Coombs

7 ΟΜΑΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ

8 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΜΑΔΑΣ ΑΙΜΑΤΟΣ Κασέτα με 6 στήλες με αντισώματα Προσθέτουμε το δείγμα (ερυθρά) Φυγοκεντρούμε Συγκολλημένα ερυθρά παραμένουν στην επιφάνεια Μη συγκολλημένα κατακάθονται ΝΕΑ ΜΕΘΟΔΟΣ

9 ΟΜΑΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ Θετική Αρνητική

10 ΟΜΑΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ

11 ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ COOMBS – ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Ανίχνευση ατελών αντισωμάτων (IgG) αντισώματα που συνδέονται με αντιγόνα ερυθρών (πχ αντι-D) χωρίς να τα συγκολλούν 1945 (Robin Coombs, Cambridge) Ερυθρά με προσκολλημένα IgG αντισώματα δεν συγκολλώνται απευθείας Εάν προσθέσουμε ένα άλλο αντίσωμα, θα αντιδράσει με τα ΙgG αντισώματα Συγκόλληση

12 ΑΜΕΣΗ ΚΑΙ ΕΜΜΕΣΗ COOMBS ΆΜΕΣΗ Ανίχνευση IgG αντισωμάτων (έναντι του αντιγόνου D του Rh) επάνω στα ερυθρά νεογνών με αιμολυτική νόσο ΈΜΜΕΣΗ Ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό ασθενών πχ ορό μητέρας Rh- μετά από γέννηση Rh+ παιδιού (προγεννητ. έλεγχος) ορό Rh- μετά από μετάγγιση Rh+ αίματος ή έλεγχος συμβατότητας

13 ΠΟΤΕ ΣΥΜΒΑΙΝΕΙ? Όταν μια Rh- μητέρα κυοφορεί Rh+ νεογνό, παράγει IgG ειδικά για τον παράγοντα Rhesus που εκφράζεται στα ερυθρά του Rh+ νεογνού της. Ακίνδυνα (χαμηλή συγκέντρ.) Σε δεύτερη εγκυμοσύνη Τα IgG αντι-Rh αντισώματα διέρχονται τον πλακούντα και προσβάλλουν τα εμβρυικά ερυθροκύτταρα Τα ερυθρά καταστρέφονται από φαγοκύτταρα του ήπατος Αιμολυτική αναιμία νεογνού ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΗ ΝΟΣΟΣ ΝΕΟΓΝΟΥ

14 ΑΜΕΣΗ COOMBS - ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ - Τα ερυθρά του αρρώστου πλένονται - Προσθέτουμε αντι-IgG αντισώματα (παράγ. Coombs) Δρουν σαν γέφυρα μεταξύ των IgG αντισωμάτων - Ορατή συγκόλληση

15 ΈΜΜΕΣΗ COOMBS Ανίχνευση IgG αντισωμάτων έναντι του D παράγοντα στον ορό του αίματος ΠΟΥ ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ?? - ορό μητέρας Rh- μετά από γέννηση Rh+ παιδιού - ορό Rh- μετά από μετάγγιση Rh+ αίματος Rhesus ευαισθητοποίηση

16 ΈΜΜΕΣΗ COOMBS έλεγχος αντισωμάτων στον ορό της μητέρας +  Coombs Reagent (Anti-IgG) Step 2 επώαση Ορός υπό εξέταση Washed test RBCs +  Step 1 0+ ΆΜΕΣΗ

17 ΈΜΜΕΣΗ COOMBS έλεγχος συμβατότητας πριν από μετάγγιση +  Coombs Reagent (Anti-IgG) Step 2 επώαση Ορός του λήπτη RBCs του δότη +  Step 1 ΆΜΕΣΗ

18 ΈΜΜΕΣΗ COOMBS

19

20 ASTO Ορολογικές αντιδράσεις Αναζητούνται στον ορό του αίματος αντισώματα έναντι μικροβίων, ιών, παρασίτων καθώς και διάφοροι παράγοντες (Ra, CRP) ASTO Αναζητούνται αντισώματα έναντι της στρεπτολυσίνης Ο του πυογόνου στρεπτόκοκκου σε άτομα που πάσχουν από στρεπτοκοκκική λοίμωξη ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ = ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΟΛΥΣΙΝΗ-Ο Group A Streptococcus: Ενδοκαρδίτιδα Ρευματοειδή πυρετό Στρεπτοκοκκική αμυγδαλίτιδα

21 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ASTO ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ LATEX ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Χρησιμοποιούνται σωματίδια latex καλυμμένα με στρεπτολυσίνη-Ο. Συγκολλώνται όταν έρθουν σε επαφή με το αντίσωμα ASTO + Ορός με αυξημένη ASTO Latex σωματίδια με αντίσωμα (από το εμπόριο) Ένωση αντιγόνου-αντισώματος Συγκόλληση

22 Ρευματοειδής παράγων RF Ο ρευματοειδής παράγων (RF) είναι αυτοαντίσωμα έναντι του τμήματος Fc της ανοσοσφαιρίνης IgG Συνήθως IgM, αλλά μπορεί και IgG, IgΑ ή IgE Ανιχνεύεται στο 80% περίπου των ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα

23 ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ LATEX Ορός με αυξημένo RF (σε πλάκα) Εναιώρημα σωματιδίων latex με IgG αντίσωμα Ανάμιξη και επώαση για 5 λεπτά Ανάλυση για ύπαρξη συγκόλλησης +

24 C-reactive protein, CRP Σφαιρίνη στον ορό του αίματος ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Ενώνεται με το C-αντιγόνο του πνευμονιόκοκκου και σχηματίζει ίζημα Ενεργοποιεί το συμπλήρωμα

25 ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ LATEX Ορός με αυξημένη CRP (σε πλάκα) Εναιώρημα σωματιδίων latex με αντίσωμα για CRP Ανάμιξη και επώαση για 5 λεπτά Ανάλυση για ύπαρξη συγκόλλησης +

26 NEΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ

27 ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ - Βασίζεται στην αντίδραση Ag-Ab - Μέτρηση σκεδασμού του φωτός από ανοσοσυμπλέγματα (40-400nm) σε διάλυμα μετά από επίδραση ακτινοβολίας - Ποσοστό σκεδαζόμενου φωτός ανάλογο της συγκέντρωση της πρωτείνης ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ RF συνδέεται με IgG (ανοσοσυμπλέγματα) Αύξηση ανοσοσυμπλεγμάτων – Θολερότητα διαλύματος Επίδραση φωτεινής πηγής Σκεδασμός φωτός ανάλογος της ποσότητας των ανοσοσυμπλεγμάτων και του RF

28 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Ποσοτικό προσδιορισμό IgG, IgM, IgA CRP, RF, πρωτείνες συμπληρώματος Παράγοντες πήξης, ορμόνες Μέθοδος μέτρησης της συγκέντρωσης των διαφόρων πρωτεϊνών στα βιολογικά υγρά

29 DIGITAL PCR ΨΗΦΙΑΚΗ PCR H ψηφιακή PCR (dPCR) είναι μία νέα μέθοδος για την ακριβή ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων. Μετρά το συνολικό αριθμό των μεμονωμένων μορίων στόχων σε ψηφιακή μορφή, επιτρέποντας πολλές εφαρμογές που απαιτούν υψηλή ευαισθησία και έχουν περιορισμένη διαθεσιμότητα του δείγματος.

30 α) Κλασική PCR: Το δείγμα περιέχει ένα ετερογενές μείγμα μορίων DNA όπου το μόριο- στόχος (π.χ. DNA μετάλλαξη) είναι παρόν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε σχέση σε το κανονικό DNA. b) Ψηφιακή PCR: Το δείγμα χωρίζεται σε πολλά κλάσματα με αραίωση (περίπου 1 αντίγραφο του DNA ανά κλάσμα) πριν την PCR, εμπλουτίζοντας έτσι τους στόχους που βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση. Aνίχνευση με φθορισμό.

31 ΣΤΑΔΙΑ

32 https://www.youtube.com/watch?v=9TJy_uegmd4

33

34

35

36

37

38