4. ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΘΕΟΔΩΡΟΣ Η. ΠΙΤΤΑΡΑΣ MD PhD Ιατρός Βιοπαθολόγος Λέκτορας Μικροβιολογίας ΕΚΠΑ.

Παρουσίαση με θέμα: "4. ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΘΕΟΔΩΡΟΣ Η. ΠΙΤΤΑΡΑΣ MD PhD Ιατρός Βιοπαθολόγος Λέκτορας Μικροβιολογίας ΕΚΠΑ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 4. ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΘΕΟΔΩΡΟΣ Η. ΠΙΤΤΑΡΑΣ MD PhD Ιατρός Βιοπαθολόγος Λέκτορας Μικροβιολογίας ΕΚΠΑ

2 Ερευνητές αναφέρουν ότι έχουν αποκωδικοποιήσει δεκάδες microRNA στο σάλιο, αυξάνοντας τις ελπίδες για την χρήση της γνώσης αυτής και των τεστ σάλιου στη βοήθεια της έγκαιρης διάγνωσης του καρκίνου του στόματος. Αναλύοντας το σάλιο ασθενών με την μέθοδο της PCR (polymerase chain reaction), ερευνητές έχουν αποκωδικοποιήσει περίπου 50 microRNAs που είναι υπεύθυνα για την διακοπή της μετάφρασης του mRNA και / ή οδηγούν σε υποβάθμιση του, σύμφωνα με την αναφορά που δημοσιεύεται στο περιοδικό Clinical Cancer Research. Από τα είδη των miRNA που βρήκαν, κάποια ήταν σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα συγκέντρωσης στο σάλιο ασθενών με OSCC (oral squamous cell carcinoma) από ότι στην ομάδα ελέγχου (P<o.o5). Δύο από αυτά τα miRNAs, miR-125a και miR-200a, εκφράζονται διαφορετικά στο σάλιο ασθενών με OSCC συγκρινόμενο με αυτό των υγιών ατόμων, αναφέρει ο David T. Wong, DMD, DMSc, στην Οδοντιατρική Σχολή του Los Angeles. Σε αυτά τα ευρήματα στηρίζονται οι επιστήμονες για την ανίχνευση miRNAs στο σάλιο και το πως αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μη-επεμβατική και ταχεία διαγνωστική μέθοδο διάγνωσης του καρκίνου του στόματος. Οι συγγραφείς αναφέρουν επίσης ότι το OSCC είναι η έκτη πιο συχνή μορφή καρκίνου στις ΗΠΑ, προκαλώντας το θάνατο σε 8000 άτομα κάθε χρόνο. Τις τελευταίες τρεις δεκαετίες, το μέσο ποσοστό πεντάχρονης επιβίωσης για το OSCC (που είναι 50%), δεν έχει αλλάξει καθόλου, προς έκπληξη όλων. Για αυτό το λόγο άλλωστε επισημαίνουν ότι η πρόωρη διάγνωση του θα μπορέσει να αυξήσει σημαντικά τα ποσοστά επιβίωσης των ατόμων που αντιμετωπίζουν αυτή τη μορφή καρκίνου. - Σημειώσεις: 1) Η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το National Institute of Dental and Craniofacial Research Αναφορά: Wong D, et al “Salivary microRNA: Discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection” Clin Cancer Res2009; 17: 5473-77. [πηγή: oralcancernews.org]oralcancernews.org Τα microRNA στο σάλιο για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του στόματος

3 ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ) ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΟΥ Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Βιοχημικές ιδιότητες Παραγωγή ενζύμων Ευαισθησία στα αντιβιοτικά ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΟΥ Μικροβιακό DNA η RNA στο κλινικό δείγμα Συγκεκριμένα γονίδια (π.χ παραγωγής τοξίνης) Μεταλλαγές στο γενετικό υλικό Σιωπηλά (silent) γονίδια

4 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ DNA = δυο δεξιόστροφες αντιπαράλληλες πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες (διπλή έλικα) Η σύνδεση των δύο ελίκων γίνεται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ: A=T & C=G (συμπληρωματικές βάσεις) → κάθε έλικα του DNA είναι συμπληρωματική της άλλης

5 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Μετουσίωση του DNA = διαχωρισμός των δυο ελίκων με  Φυσικούς (π.χ θερμοκρασία)  Χημικούς ( π.χ NaOH) cDNA = μονόκλωνο DNA (συμπληρωματικό) Υβριδισμός του DNA = συνένωση των δυο συμπληρωματικών ελίκων Ανιχνευτής νουκλεϊνικού οξέος η ιχνηλάτης(probe) = ένα φυσικό η τεχνητό κομμάτι δίκλωνου η μονόκλωνου DNA η RNA που έχει σημανθεί με ένζυμο, φθορίζουσα ουσία, αντιγονικό υπόστρωμα, ρασιοϊσότοπα, χημική ομάδα χημειοφωταύγειας  Μέγεθος = 20-2500 bp  Τεχνητός ανιχνευτής μεγέθους <50 bp = “ολιγονουκλεοτιδικός ανιχνευτής”

6

7 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ DNA πολυμεράση = ένζυμο που καταλύει την αντιγραφή του DNA  Θερμοανθεκτική (Taq) διατηρεί τη βιολογική της δράση σε υψηλές (π.χ 72 o C) θερμοκρασίες  Πολλών ειδών φυσικές η τεχνητές πολυμεράσες με διαφορετική δράση (π.χ. AmpliTaq)  Η δράση τους εξαρτάται από τη συγκέντρωση ιόντων MgCI 2 ή MnCI 2 ή MgSO 4 Εναρκτήριος ανιχνευτής- οδηγός νουκλεϊνικού οξέος ή εκκινητής (primer) = ένα μικρό φυσικό κομμάτι RNA η τεχνητό κομμάτι μονόκλωνου DNA (5΄→3΄) που ενώνεται με το “άκρο” της μητρικής DNA αλυσίδας και - παρουσία της DNA πολυμεράσης- αρχίζει τη σύνθεση της νέας, συμπληρωματικής αλυσίδας Ανάστροφη τρανσκριπτάση (RT) = ένζυμο που καταλύει την αντιγραφή του RNA σε c DNA (μονόκλωνο)

8 ΒΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ DNA Ειδική πέψη του DNA από περιοριστικές ενδονουκλεάσες (digestion) Κλωνοποίηση του DNA (cloning) = ένα ειδικό τμήμα του DNA ενσωματώνεται σε ένα ταχέως αντιγραφόμενο γενετικό συστατικό (πλασμίδιο ή ιό) με αποτέλεσμα τη σταθερή επαγωγή του σε κύτταρα βακτηρίων η μυκήτων Υβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων (hybridization) = καθιστά δυνατό να τακτοποιηθούν ειδικές αλληλουχίες του DNA με μεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία λόγω της ικανότητας τους να προσδένονται σε συμπληρωματικές αλληλουχίες νουκλεϊνικού οξέος Καθορισμός της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του DNA σε ένα κλωνοποιημένο τμήμα DNA (sequencing)

9 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ DNA Ανίχνευση και προσδιορισμός γονιδίων που ενέχονται σε νεοπλασματικές και κληρονομικές ασθένειες π.χ. χρόνια μυελογενής λευχαιμία, κυστική ίνωση Προγεννητικός έλεγχος και διάγνωση κληρονομικών παθήσεων π.χ. φαινυλκετονουρία Προσδιορισμός της γενετικής προδιάθεσης για ασθένειες π.χ. σακχαρώδης διαβήτης, αθηροσκλήρωση Ακριβής διάγνωση και σταδιοποίηση νεοπλασματικών καταστάσεων Πρόγνωση της εξέλιξης και θεραπευτικός έλεγχος στους καρκινοπαθείς Διάγνωση λοιμώξεων Προσδιορισμός της ευαισθησίας ή της αντοχής σε χημειοθεραπευτικά π.χ. νεοπλασματικές ασθένειες, λοιμώξεις έλεγχος ιστοσυμβατότητας πριν τις μεταμοσχεύσεις  Έλεγχος πατρότητας  Ιατροδικαστικοί προσδιορισμοί

10 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ DNA ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Οι μοριακές διαγνωστικές μέθοδοι διακρίνονται σε 1. Μη πολλαπλασιαστικές (συμβατικές) του μικροβιακού γενετικού υλικού ανιχνεύεται το DNA η το RNA του μικροβίου με τη βοήθεια σεσημασμένων ανιχνευτών 2. Πολλαπλασιαστικές του μικροβιακού γενετικού υλικού ανιχνεύεται το DNA ή το RNA του μικροβίου αφού πρώτα αντιγραφεί σε vx10 6 αντίγραφα  Ποιοτικές (end-point)  Ποσοτικές κυρίως με τη χρήση σεσημασμένων ιχνηλατών (probes) του DNA

11 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ DNA ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Εγγενείς αδυναμίες των μοριακών διαγνωστικών μεθόδων Δεν προσδιορίζουν αν το ανιχνεύσιμο μικροβιακό γενετικό υλικό προέρχεται από ζωντανά η νεκρά μικροβιακά κύτταρα (όταν ανιχνεύεται μικροβιακό DNA) Δεν προσδιορίζουν αν το μικρόβιο του οποίου το γενετικό υλικό ανιχνεύεται, είναι και το αίτιο της λοίμωξης

12 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ DNA ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Αντίθετα Οι καλλιεργητικές μέθοδοι εξασφαλίζουν την βιωσιμότητα του μικροβιακού παράγοντα (αφού μόνο ζωντανά κύτταρα του μικροβίου που υπάρχουν στο κλινικό δείγμα είναι δυνατό να καλλιεργηθούν) Οι ορολογικές και ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι εξασφαλίζουν τη συμμετοχή του μικροβιακού παράγοντα στη λοίμωξη (αφού προσδιορίζονται ειδικά IgG ή/ και IgM αντισώματα έναντι του συγκεκριμένου μικροβιακού παράγοντα)

13

14 1. Μέθοδοι μη πολλαπλασιαστικές (συμβατικές) του μικροβιακού γενετικού υλικού Υ Β Ρ Ι Δ Ι Σ Μ Ο Σ Υβριδισμός σταθερής φάσης Υβριδισμός υγρής φάσης Υβριδισμός in situ (ISH)

15

16 Υβριδισμός σταθερής φάσης Αρχή: Παραλαβή DNA ή RNA από μικροβιακά κύτταρα → («κοπή» του DNA σε πολλαπλά, μικρά κομμάτια με τη βοήθεια περιοριστικών ενδονουκλεασών) → (διαχωρισμός τμημάτων κατά τάξη μεγέθους με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης) → (κατεργασία πηκτής με NaOH για μετουσίωση του DNA) ακινητοποίηση (καθήλωση) τμημάτων DNA ή RNA σε στερεό υπόστρωμα (φίλτρο nylon ή νιτροκυτταρίνη) → υβριδισμός με σεσημασμένο DNA - ανιχνευτή απομάκρυνση (με πλύσιμο) μονόκλωνων DNA ανίχνευση των σεσημασμένων διμερών κατά περίπτωση σήμανσης

17 Υβριδισμός σταθερής φάσης Τρόποι σήμανσης και τελικής ανίχνευσης του DNA - ανιχνευτή (probe) : Με ραδιενεργά ισότοπα (P 32 )→ αυτοραδιογραφία ή μετρητής β ή γ ακτινοβολίας Με βιοτίνη → αβιδίνη+υπεροξειδάση → διαμινοβενζιδίνη → χρώμα (φωτομέτρηση) Με διγοξιγενίνη → Ab + αλκαλική φωσφατάση → άλας τετραζολίου, ινδοξυ-φωσφορικό → χρώμα (φωτομέτρηση) Με εστέρες της ακριδίνης → υπόστρωμα → χημειοφωταύγεια → αυτοραδιογραφία ή λουμινόμετρο

18

19

20 Υβριδισμός σταθερής φάσης Παραλλαγές βασικής μεθόδου: Υβριδισμός αποτυπωμένης κουκκίδας (dotblot) ή κηλίδας (spotblot) Υβριδισμός βακτηριακών αποικιών (colony hybridization) Υβριδισμός sandwich

21 Υβριδισμός αποτυπωμένης κουκκίδας (dotblot) ή κηλίδας (spotblot) χρήση: Δοκιμασία screening και τυποποίηση HPV ίων { HPV (Human Papilloma Virus) Ιός επιπέδων κονδυλωμάτων } μέθοδος: Λύση κυττάρων → μετουσίωση DNA → μεταφορά και ακινητοποίηση σε φίλτρο nylon → υβριδισμός → ανίχνευση των σεσημασμένων διμερών κατά περίπτωση σήμανσης

22 Υβριδισμός βακτηριακών αποικιών (colony hybridization) Ο υβριδισμός γίνεται κατευθείαν σε αποικίες βακτηρίων μέθοδος: Λύση μικροβίων → μετουσίωση DNA → μεταφορά και ακινητοποίηση σε φίλτρο nylon → υβριδισμός → ανίχνευση των σεσημασμένων διμερών κατά περίπτωση σήμανσης πλεονέκτημα: Ταυτόχρονη εξέταση πολλών DNA

23 Υβριδισμός sandwich μέθοδος: Χρησιμοποιούνται δυο διαφορετικοί DNA - ανιχνευτές, που συνδέονται σε διαφορετικά τμήματα του DNA-στόχου:  Ένας βρίσκεται προσκολλημένος στο φίλτρο nylon  Ένας (σεσημασμένος) χρησιμεύει σαν «προσδιοριστής» Πλεονέκτημα : μεγαλύτερη ευαισθησία

24

25 Υβριδισμός υγρής φάσης αρχή: Το DNA - στόχος και ο σεσημασμένος DNA - ανιχνευτής αφήνονται να αντιδράσουν σε υδατικό διάλυμα → υβριδισμός → απομάκρυνση των μονόκλωνων DNA-ανιχνευτών είτε με πέψη (S1 νουκλεάση ή υδρολύει μονόκλωνα DNA) είτε με ειδική απορρόφηση του δίκλωνου (υβριδισμένου) DNA από στήλες υδροξυαπατίτη → μέτρηση του σήματος υβριδισμού

26 Υβριδισμός υγρής φάσης Ποσοτική μέθοδος Γρήγορη μέθοδος Ο DNA-ανιχνευτής πρέπει να είναι μικρό μονόκλωνο DNA, που δεν αυτοϋβριδίζεται εφαρμογή: ποσοτικός προσδιορισμός του DNA του ιού ηπατίτιδας B (HBV) στον ορό με τη χρήση 125 I - σεσημασμένου DNA - ανιχνευτή → χρόνιοι φορείς υπό αντιιϊκή αγωγή → εκτίμηση θεραπευτικού αποτελέσματος

27 Υβριδισμός in situ (ISH) αρχή: ο υβριδισμός γίνεται απευθείας στο βιολογικό υλικό (μολυσμένος ιστός) προϋπόθεση: προσέγγιση του γενετικού υλικού του μικροβίου χωρίς καταστροφή της ανατομικής μορφολογίας των ιστών πλεονεκτήματα: σε συνάρτηση με τη κυτταρολογική εικόνα των ιστών και τη κλινική εικόνα του ασθενούς:  Το μικρόβιο - στόχος συμμετέχει στη λοίμωξη  Διασπορά και ποσότητα του μικροβίου-στόχου

28

29 2. Μέθοδοι Πολλαπλασιαστικές του μικροβιακού γενετικού υλικού Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR-Polymerase Chain Reaction] Η PCR επέτρεψε την παραγωγή ενός πολύ μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας συγκεκριμένης και προκαθορισμένης αλληλουχίας DNA Η PCR χρησιμοποιεί τις θεμελιώδεις βιοχημικές αρχές της αντιγραφής του DNA και αποτελεί μέθοδο in vitro πολλαπλασιασμού μιας προκαθορισμένης και γνωστής αλληλουχίας DNA Η μέθοδος βασίζεται στην ενζυματική επιμήκυνση «εκκινητών» (primers) που υβριδίζονται σε αντίστοιχα σημεία του υπό ανίχνευση DNA και επιμηκύνονται με τη βοήθεια της DNA πολυμεράσης, χρησιμοποιώντας σα «μήτρα» την υπό μελέτη αλληλουχία

30 Μέθοδοι Πολλαπλασιαστικές του μικροβιακού γενετικού υλικού Οι μοριακές μέθοδοι (NAATs) στηρίζονται στην ενίσχυση και τον πολλαπλασιασμό του νουκλεϊνικού οξέος των μικροοργανισμων, με τη δυνατότητα να ανιχνεύουν ακόμη και έναν Θεωρούνται περισσότερο ευαίσθητες από την κυτταροκαλλιέργεια, την κλασσική μέθοδο αναφοράς Μεγάλο πλεονέκτημα των μοριακών μεθόδων είναι η δυνατότητα εφαρμογής τους σε μη επεμβατικά δείγματα, όπως (ούρα, κολπικά δείγματα, ενδοκολπικά ταμπόν)

31 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR- Polymerase Chain Reaction] Συγκεκριμένα με την PCR γίνεται σύνθεση in vitro ενός τμήματος DNA που μπορεί να είναι χρωμοσωματικό DNA ανθρώπου ή DNA μικροοργανισμού ή ιού ή ακόμα και πλασμιδίου Σε ένα χρονικό διάστημα 3-4 ωρών παράγεται η συγκεκριμένη περιοχή σε ανάτυπα περισσότερα από 1x10 6 και η όλη αντίδραση λαμβάνει μέρος στο ίδιο μείγμα αντιδραστηρίων Ως δείγματα στη PCR μπορεί να χρησιμοποιηθούν καθαρό απομονωμένο DNA, ολικό αίμα, αποικίες μικροβίων, επιθηλιακά κύτταρα, σπερματοκύτταρα, παθολογοανατομικά παρασκευάσματα ακόμη και αρχαιολογικό υλικό κ.α Η εφαρμογή της μεθόδου σε ποικιλία δειγμάτων και η ειδικότητά της την κατέταξε στις πολύ ειδικές και ευαίσθητες τεχνικές σε μικρό χρονικό διάστημα

32 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR-Polymerase Chain Reaction] H αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ποσοτική μεγέθυνση ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA. Η PCR πρωτοεφαρμόστηκε από μία ομάδα ερευνητών (Mullis, Faloona, Saiki) στην εταιρία Cetus και από τότε προκάλεσε επανάσταση στη βιοϊατρική έρευνα.

33 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR-Polymerase Chain Reaction] Στη πράξη μετά από 30 έως 35 θερμικούς κύκλους,η αλληλουχία που περικλείεται από τους δυο «εκκινητές», έχει πολλαπλασιαστεί περίπου 10 6 φορές Μειονέκτημα εργαστηριακής εφαρμογής: Επιμολύνσεις από εξωγενές, ομόλογο DNA

34 Η εκθετική μεγέθυνση του γονιδίου μέσω της PCR

35 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR-Polymerase Chain Reaction] Η DNA πολυμεράση αποτελεί το ένζυμο αντιγραφής DNA σε κάθε κύτταρο κατά τη διαίρεσή του. Στο διαιρούμενο κύτταρο, κατά την διάρκεια της ευθυγράμησης των δύο κλώνων του DNA, το ένζυμο πολυμεράση διαβάζει τον ένα κλώνο (μονόκλωνο DNA) και έχοντάς τον ως πρότυπο (template), συνθέτει συμπληρωματική άλυσο DNA με κατεύθυνση από 5΄ προς 3΄ άκρο αρχίζοντας όμως από περιοχή δίκλωνου DNA ως άλυσο αφετηρία παρουσία τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων και ιόντων Mg++. Επιλέγεται ένα τμήμα του DNA που αποτελεί το στόχο (target) DNA, το οποίο με πολλαπλές αντιγραφές μεγεθύνεται. Ο στόχος DNA αποτελεί το πρότυπο DNA στην ενζυμική αντίδραση της πολυμεράσης και ως άλυσοι αφετηρίες (primers) χρησιμοποιούνται δύο συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια που έχουν δομή συμπληρωματική προς τις πλευρικές αλληλουχίες του DNA στόχου, το κάθε ένα αντίστοιχα προς τον ένα κλώνο του στόχου και με αντίθετη κατεύθυνση.

36 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR-Polymerase Chain Reaction] Η σειρά των τριών σταδίων 1. μετουσίωσης (denaturation), 2. σύνδεσης ή υβριδισμού των αφετηριών (annealing) και επέκτασης των αφετηριών 3. σύνθεση καινούριου κλώνου DNA (extension), αποτελούν ένα κύκλο της αντίδρασης PCR.

37

38 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR- Polymerase Chain Reaction] Το ένζυμο DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι μία μορφή θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης, η οποία έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus (Taq) και δεν καθίσταται ανενεργό στις επαναλαμβανόμενες υψηλές θερμοκρασίες που απαιτούνται για τη μετουσίωση του στόχου DNA.

39 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [PCR- Polymerase Chain Reaction] Ο έλεγχος προϊόντων της PCR γίνεται με αναγνώριση του προϊόντος της PCR μετά από την αντίδραση: 1)ηλεκτροφορητικά σε πήκτωμα αγαρόζης για τον καθορισμό του μεγέθους του προϊόντος. Με την ηλεκτροφόρηση αναγνωρίζεται το μοριακό μέγεθος του προϊόντος σε σύγκριση με DNA δείκτες γνωστού μοριακού μεγέθους. 2)με υβριδισμό σημείου (dot blot) σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή nylon και με ανιχνευτή σημασμένο ισοτοπικά ή μη ισοτοπικά (βιοτίνη, διγοξιγενίνη) για ειδική ανίχνευση των δειγμάτων με αυτοραδιογραφία ή χρωματομετρικά και με χημειοφωταύγεια αντίστοιχα. 3)με προσδιορισμό της αλληλουχίας των βάσεων του προϊόντος της PCR (DNA sequencing). Η μέθοδος αυτή είναι η πιο καθοριστική και διαφωτιστική αλλά και η δυσκολότερη για τον έλεγχο των αποτελεσμάτων και είναι απαραίτητη όταν υπάρχουν άγνωστες μεταλλάξεις στο τμήμα που μεγεθύνθηκε.

40

41

42 Παραλλαγές PCR 1. Nested PCR 2. Multiplex PCR 3. RT-PCR (πολλαπλασιασμός του RNA) 4. RT-PCR πραγματικού χρόνου (Real-time PCR)

43 1. Nested PCR(Φωλεακό PCR) αρχή: Χρησιμοποιούνται δυο ζεύγη primers → το 2 ο πολλαπλασιάζει τμήμα του DNA που προέρχεται από πολλαπλασιασμό του DNA - στόχου από το 1 ο ζεύγος πλεονέκτημα: Αυξάνεται η ευαισθησία της PCR → πολλαπλασιάζεται ήδη πολλαπλασιασμένο τμήμα DNA

44 2. Multiplex PCR(Πολλαπλό PCR) αρχή: Χρησιμοποιούνται δυο ζεύγη primers για να πολλαπλασιάσουν ταυτόχρονα (στην ίδια αντίδραση) δυο ανεξάρτητα τμήματα DNA - στόχων του ίδιου ή διαφορετικού γενετικού υλικού παραλλαγή: Ποσοτική ή συναγωνιστική PCR: συγκρίνεται το προϊόν μιας PCR που ξεκινά από άγνωστη ποσότητα DNA - στόχου με το προϊόν της PCR που ξεκινά από γνωστή ποσότητα DNA - στόχου ταυτόχρονη ενίσχυση πολλαπλών στόχων

45 3. RT-PCR (πολλαπλασιασμός του RNA) PCR αντίστροφης μεταγραφής (Reverse transcription PCR, PCR αντίστροφης μεταγραφής) αρχή: 1 η αντίδραση: RNA θ=37 o C → cDNA (ένζυμο: ανάστροφη τρανσκριπτάση, RT) 2 η αντίδραση: cDNA → μήτρα για PCR Σήμερα χρησιμοποιείται το ανασυνδυασμένο θερμοανθεκτικό ένζυμο Tth pol το οποίο σε θερμοκρασίες 55-75 ο C έχει:  Δράση ανάστροφης πολυμεράσης παρουσία MnCI 2  Δράση πολυμεράσης παρουσία MgCI 2

46 4. RT-PCR πραγματικού χρόνου ( Real-time PCR) αρχή: Χρησιμοποιείται απαρχής ένας φθοριοσεσημασμένος ιχνηλάτης (probe) DNA ο οποίος όταν συνδεθεί με δίκλωνο DNA εκπέμπει φθορίζουσα ακτινοβολία (μετράται σε ειδικό μηχάνημα) σε ποσότητα ανάλογη του παραγομένου προϊόντος της PCR πλεονέκτημα: Ποσοτική μέθοδος ευκολόχρηστη, φθηνή και ευαίσθητη

47 RT-PCR πραγματικού χρόνου ( Real-time PCR) Είναι η διαδικασία ενίσχυσης μιας DNA αλληλουχίας με τη μέθοδο της PCR και ταυτόχρονα της ανίχνευσης του παραγόμενου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο καθ’ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης (Real-time PCR).

48 Μέχρι πριν λίγα χρόνια οι Βιολόγοι μελετούσαν τα γονίδια και τις πρωτεΐνες κάθε ένα ξεχωριστά. Στα γονίδια έγινε: Χαρτογράφηση Κλωνοποίηση & PCR Μεταλλαξογένεση Αλληλουχοποίηση Ανάλυση των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν

49 Έτσι μελετήθηκαν πολλά γονίδια Πρόγραμμα ανθρώπινου γονιδιώματος 30.000 γονίδια Γονιδιώματα άλλων οργανισμών (E.coli, Drosophila,ποντικού κ.λ.π.) Για να γίνει εφικτή η εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ολόκληρων γονιδιωμάτων επιστρατεύθηκαν αυτοματοποιημένοι μηχανισμοί

50

51

52

53

54 Humans, Homo sapiens; see Human genome project HumansHuman genome project Neanderthal, "Homo neanderthalensis" (partial) Neanderthal Haemophilus influenzae, a bacterium (the first free-living organism to have its genome fully sequenced) Haemophilus influenzae Common House Mouse, Mus musculus Common House Mouse Brown Rat, Rattus norvegicus Brown Rat Common Chimpanzee Pan troglodytes; see Chimpanzee Genome Project Common ChimpanzeeChimpanzee Genome Project Rhesus Macaque, Macaca mulatta Rhesus Macaque Domestic Chicken, Gallus gallusChicken Tammar Wallaby, Macropus eugenii Tammar Wallaby Domestic Cat, Felis silvestrisCat Domestic Dog, Canis lupus familiarisDog Common fruit fly, Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster Baker's yeast, Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae Red bread mold, Neurospora crassaNeurospora crassa Thale Cress, Arabidopsis thalianaArabidopsis thaliana Rice, Oryza sativa Rice Common Wheat, Triticum aestivumWheat Maize, Zea mays Maize Poplar, Populus trichocarpa (The first tree to have its genome fully sequenced) PoplarPopulus trichocarpa Escherichia coli, a coliform bacterium Escherichia coli SARS virus Purple-spined sea urchin, Arbacia punctulata Purple-spined sea urchin Caenorhabditis elegans, a nematode worm Caenorhabditis elegansnematode Zebra Danio, Brachydanio rerio Zebra Danio African clawed frog, Xenopus laevis African clawed frog Oryzias latipes, a medakafish Oryzias latipes Tiger blowfish, Takifugu rubipresTakifugu rubipres Tomato Solanum lycopersicum Tomato Potato Solanum tuberosum Potato Western Honey bee, Apis melliferaApis mellifera Grapevine, Vitis vinifera L. GrapevineVitis vinifera L. Spanish flu

55 Γνωρίζοντας την αλληλουχία νουκλεοτιδίων ολόκληρου του γονιδιώματος Χρονοβόρα διαδικασία η μελέτη της λειτουργίας κάθε γονιδίου ξεχωριστά και ακόμη περισσότερο της αλληλεπίδρασης μεταξύ τους

56 Επιθυμητή η: - ταυτόχρονη μελέτη ΠΟΛΛΩΝ γονιδίων - ταυτόχρονη μελέτη ΟΛΩΝ των γονιδίων ενός οργανισμού

57 Genomics Συστηματική μελέτη του συνόλου του γενετικού υλικού ενός οργανισμού (δομή και λειτουργία) Εξετάζονται οι μοριακοί μηχανισμοί και η αλληλεπίδραση των γενετικών και περιβαλλοντικών παραμέτρων στις ασθένειες

58 Αν και κάθε κύτταρο ενός οργανισμού φέρει το ίδιο DNA… Διαφορετικά γονίδια εκφράζονται σε κάθε διαφορετικό ιστό  διαφορετικά RNA Ποιοτική και ποσοτική διαφορά

59 Συγκρίνοντας το προφίλ γονιδιακής έκφρασης διαφορετικών κυττάρων μπορούμε να διακρίνουμε κατά πόσον αυτά διαφέρουν μεταξύ τους

60 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ PCR ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Διάγνωση λοιμώξεων στις οποίες ο αριθμός των μικροβίων είναι μικρός  Μηνιγγίτιδα  Χρονία λοίμωξη με Trypanosoma crusi Ανίχνευση λοιμογόνων παραγόντων που καλλιεργούνται δύσκολα η καθόλου  Μυκοβακτηρίδια  Treponema pallidum  Ehrilichia chaffeensis (αίτιο της ανθρώπινης ερλιχίωσης)  Rochalimaea quintana (ρικέτσια, αίτιο της βακτηριακής αγγειωμάτωσης) Αντικατάσταση τεχνικών άμεσου ανοσοφθορισμού ή χρονοβόρων ορολογικών δοκιμασιών  Borrelia burgdorferi (αίτιο της νόσου Lyme)

61 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ PCR ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Ανίχνευση γονιδίων αντοχής στα αντιβιοτικά Εργαστηριακή διάγνωση ιογενών λοιμώξεων Μελέτη της φυσικής ιστορίας λοιμωδών νοσημάτων  Όρια μεταγραφής και μετάφρασης του DNA που απαιτούνται για την κλινική εκδήλωση της λοίμωξης Τυποποίηση και ταξινόμηση μικροβίων με βάση γενετικούς δείκτες Αντικατάσταση κλασσικών μεθόδων εργαστηριακής διάγνωσης κατά περίπτωση

62