Υβριδοποίηση νουκλεϊνικών οξέων- Ανίχνευση αλληλουχιών Όταν ένα υδατικό διάλυμα DNA θερμανθεί στους 100 ο C ή εκτεθεί σε πολύ αλακαλικό pH, σπάζουν οι.

Παρουσίαση με θέμα: "Υβριδοποίηση νουκλεϊνικών οξέων- Ανίχνευση αλληλουχιών Όταν ένα υδατικό διάλυμα DNA θερμανθεί στους 100 ο C ή εκτεθεί σε πολύ αλακαλικό pH, σπάζουν οι."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Υβριδοποίηση νουκλεϊνικών οξέων- Ανίχνευση αλληλουχιών Όταν ένα υδατικό διάλυμα DNA θερμανθεί στους 100 ο C ή εκτεθεί σε πολύ αλακαλικό pH, σπάζουν οι υδρογονικοί δεσμοί ανάμεσα στις συμπληρωματικές βάσεις και το DNA αποδιατάσσεται. Μονόκλωνες συμπληρωματικές αλυσίδες DNA αν μείνουν για αρκετό διάστημα στους 65 ο C παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος, επανα- σχηματίζονται διπλές έλικες με υβριδοποίηση. Υβριδοποίηση μπορεί να συμβεί ανάμεσα σε οποιονδήποτε συνδυασμό δυο αλυσίδων νουκλεϊνικών οξέων (DNA:DNA, RNA:RNA, DNA:RNA). 1

2 Ανάλυση νουκλεϊνικών οξέων: μέθοδοι “Southern” και “Northern” Η μεταφορά “Southern” (Southern blot) αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για την ανάλυση της δομής των γονιδίων. Σύμφωνα με αυτή το ευκαρυωτικό DNA, κόβεται με μια ή περισσότερες ενδονουκλεάσες περιορισμού και ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα αγαρόζης. Το πήκτωμα μεταφέρεται σε διάλυμα ΝaCl/NaOH ώστε να αποδιαταχτούν οι ζώνες του DNA και στη συνέχεια ξεπλένεται, εξουδετερώνεται και τοποθετείται πάνω σε χαρτί εμποτισμένο με ρυθμιστικό διάλυμα ΝaCl/κιτρικού νατρίου. Πάνω από το πήκτωμα τοποθετείται φύλλο νιτροκυτταρίνης και πάνω από αυτό αρκετές χαρτοπετσέτες και ένα βάρος. Το ρυθμιστικό διάλυμα κινείται προς τα πάνω μεταφέροντας μαζί του και το αποδιαταγμένο DNA. Όταν έρθει σε επαφή με την νιτροκυτταρίνη προσδένεται πάνω της με μεγάλη σταθερότητα. 2

3 Η πρόσδεση του DNA γίνεται μόνιμη όταν η νιτροκυτταρίνη θερμανθεί και στεγνώσει. Έτσι έχει μεταφερθεί στη νιτροκυτταρίνη ένα αντίγραφο ζωνών του DNA στο πήκτωμα. Το φύλλο της νιτροκυτταρίνης μπορεί να υβριδοποιηθεί με τον κατάλληλο ραδιενεργό ανιχνευτή (cDNA, RNA ή ολιγονουκλεοτίδιο). Το αποτέλεσμα της υβριδοποίησης, δηλαδή ο αριθμός και το μέγεθος των κομματιών DNA που είναι συμπληρωματικά με κάποιο τμήμα του ανιχνευτή, γίνεται ορατό με αυτοραδιογραφία. Από τα μεγέθη των κομματιών μπορεί να κατασκευαστεί ο χάρτης περιορισμού του γονιδίου. 3

4 Ανάλογα με τον ανιχνευτή που διαθέτουμε, η μέθοδος αυτή επιτρέπει: -Εντοπισμό γονιδίων (εξωνίων, εσωνίων, ρυθμιστικών αλληλουχίων) σε χρωμοσωμικούς κλώνους ή ακόμα και σε μη κλωνοποιημένo DNA. -Ανάλυση της οργάνωσης γενωμικού DNA (δυνατότητα χαρτογράφησης επικαλυπτόμενων χρωοσωμικών κλώνων, αν χρησιμοποιηθεί μικρό τμήμα ενός χρωμοσωμικού κλώνου ως ανιχνευτής για ανίχνευση επικαλυπτόμενου κλώνου)(χρωμοσωμικό βάδισμα). -Ανίχνευση δομικά συγγενών γονιδίων στο ίδιο είδος (ορθόλογα) και ομολόγων γονιδίων σε διαφορετικά είδη (παράλογα). -Ανίχνευση των γονιδιακών ανακατατάξεων και εξαλείψεων που έχουν βρεθεί σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες. 4

5 Chromosome walking 5

6 Μια ανάλογη τεχνική για ανάλυση του RNA έχει ονομαστεί μεταφορά “Northern”. Ολικό RNA ή mRNA ηλεκτροφορείται σε αποδιατακτικό πήκτωμα αγαρόζης. Γίνεται μεταφορά των ζωνών RNA από το πήκτωμα σε ειδικό χαρτί που δεσμέυει το RNA, υβριδοποίηση με κατάλληλο ραδιενεργό ανιχνευτή και αυτοραδιογραφία. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει: -Προσδιορισμό του πραγματικού μεγέθους ενός mRNA -Προσδιορισμό των ιστών ή κυτταρικών τύπων που εκφράζουν ένα γονίδιο. -Προσδιορισμό του χρόνου εμφάνισης συγκεκριμένων mRNA στο κύτταρο -Ανάλυση της επίδρασης ρυθμιστικών παραγόντων στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων (π.χ. σύγκριση αποτυπωμάτων RNA που προέρχονται από κύτταρα που έχουν υποστεί διαδικασία επαγωγής και αυτών που δεν την έχουν υποστεί). -Με αντίστοιχο τρόπο μπορεί να γίνει μεταφορά πρωτεϊνών (μέθοδος Western, Western blot). Με τη μέθοδο αυτή μπορούν να μελετηθούν διάφορες αλληλεπιδράσεις DNA- πρωτεϊνών, RNA- πρωτεϊνών και πρωτεϊνης-πρωτεϊνης. 6

7 DNA μικροσυστοιχίες Οι DNA μικροσυστοιχίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση DNA (ως συγκριτικός γενωματικός υβριδισμός), ή την ανίχνευση RNA (γνωστό ως cDNA) το οποίο μπορεί να μεταφραστεί σε πρωτεϊνες. Η διαδικασία προσδιορισμού της γενετικής έκφρασης μέσω του cDNA ορίζεται ως ανάλυση της έκφρασης ή προφίλ έκφρασης. Ολιγονουκλεοτίδια ονομάζονται μικρές ακολουθίες DNA μήκους 20 έως 70 νουκλεοτίδια. Διατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων μπορούν να παρασκευαστούν εφόσον επαρκής πληροφορία για την αλληλουχία του γονιδιώματος ή του μεταγραφήματος ενός οργανισμού είναι γνωστή. Επομένως ο αριθμός των οργανισμών που είναι κατάλληλοι για αυτή την τεχνολογία είναι περιορισμένος. Από την άλλη μεριά, αποτελεί πλεονέκτημα το ότι τα ολιγονουκλεοτίδια μπορεί να αποτελούνται από οποιοδήποτε τμήμα γνωστού γονιδιώματος. 7

8 Πολυμορφισμός μονού νουκλεοτιδίου (SNP) Για τη μελέτη πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου συνήθως χρησιμοποιούνται μέθοδοι σύγκρισης ακολουθιών ή τεχνικές που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Αλλά όταν έχουμε έναν πίνακα πιθανών πολυμορφισμών οι οποίοι έχουν αναγνωριστεί και ταξινομηθεί, η ανάλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί με την χρήση των μικροδιατάξεων υβριδισμού για χιλιάδες πολυμορφισμούς (SNPs ) ταυτόχρονα. Ένας τέτοιος πίνακας που έχει ήδη βγει στην παραγωγή εξακριβώνει πολυμορφισμούς στα γονίδια Cytochrome P450. Tο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του ζυμομήκυτα (Saccharomyces serevisiae) διερευνήθηκε με τις μικροσυστοιχίες DNA το 1997. 8

9 Οι μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων χρησιμοποιήθηκαν ευρέως στην έρευνα. Χαρακτηριστική είναι η χρήση τους στη μελέτη χρωμοσωμικών ανωμαλιών, της ποικιλίας στην συρραφή που παρουσιάζεται στο μεταγράφημα συγκεκριμένου είδους κυττάρων και στην εύρεση γονιδιακών μεταλλάξεων ή γονιδιακών πολυμορφισμών. Οι SNPs μπορούν επίσης να παίζουν ρόλο δεικτών στο γονιδίωμα. Υψηλής πυκνότητας μικροδιατάξεις SNPs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εύρεση μεγάλης έκτασης απαλοιφών και προσαυξήσεων στο γονιδίωμα. Απώλεια της ετεροζυγωτίας συμβαίνει όταν μία περιοχή ενός χρωμοσώματος απαλείφεται. 9

10 Διάγραμμα συστοιχιών μικροδιατάκτες 10