Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων.

Παρουσίαση με θέμα: "Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Ενζυμική Βιοτεχνολογία Τεχνολογία Καθαρισμού Ενζύμων

2 Ορισμός Ενζύμου Μια πρωτεΐνη που έχει την ιδιότητα της καταλύσης, δηλαδή της μετατροπής ενός υποστρώματος σε προϊόν

3 Κατάταξη Ενζύμων με βάση τον όγκο παραγωγής και αγοράς Μεγάλου όγκου ή βιομηχανικά ένζυμα (industrial enzymes) Μικρού όγκου ή υψηλής προστιθέμενης αξίας ένζυμα (high added value enzymes) Εξωκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Χαμηλή καθαρότητα Μεγάλες ποσότητες παραγωγής Φθηνό κόστος παραγωγής και αγοράς Ενδοκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Υψηλή καθαρότητα Μικρές ποσότητες παραγωγής Ακριβό κόστος παραγωγής και αγοράς

4 Προέλευση Ενζύμων Ζωικής Προέλευσης Λιπάση (πάγκρεας χοίρου, βιομηχανία καλλυντικών) Θρυψίνη (πάγκρεας μόσχου και χοίρου, επεξεργασία δέρματος) Αφυδρογονάσες (καρδιακό ή σκελετικό μυ θηλαστικών, διαγνωστική και αναλυτική επιστήμη) Φυτικής Προέλευσης Παπαΐνη (Carica Papaya, ζυθοποιία) Οξαλοξική οξειδάση (ρίζες κριθαριού, προσδιορισμός οξαλοξικού οξέος) Υπεροξειδάση (ραφανίδα, ένζυμο δείκτης ενζυμικών αντιδράσεων) Μικροβιακής Προέλευσης Περιοριστικά ένζυμα (διάφοροι μικροοργανισμοί, μοριακή βιολογία)

5 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Τι είναι; Συστήματα παραγωγής πρωτεϊνών ως αποτέλεσμα έκφρασης ανασυνδυασμένων γονιδίων που κωδικοποιούν τα επιθυμητά πολυπεπτίδια Πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης διατηρούν και εκφράζουν τα επιθυμητά ανασυνδυασμένα γονίδια στα συστήματα έκφρασης Συστήματα έκφρασης: προκαρυωτικοί και ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί, κυτταροκαλλιέργειες ανώτερων οργανισμών, φυτά, ζώα, cell-free συστήματα έκφρασης...

6 Cell-freeΒακτήρια Ζύμες Έντομα Κύτταρα θηλαστικών Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Διαγονιδιακά ζώα Διαγονιδιακά φυτά

7 Ετερόλογη Έκφραση: Τι χρειαζόμαστε; DNA με το γονίδιο στόχο Πλασμιδιακός φορέας έκφρασης Σύστημα έκφρασης Συνθήκες έκφρασης

8 Κύριες εφαρμογές: Παραγωγή πρωτεϊνών που συναντώνται σε χαμηλές ποσότητες στις φυσικές πηγές, για άμεση απομόνωση και λειτουργική-δομική τους ανάλυση. Βιομηχανική παραγωγή πρωτεϊνών για βιοφαρμακευτική χρήση. Χαρακτηρισμό πρωτεϊνών που έχουν ανιχνευθεί μέσω τεχνικών reverse genetics. Δομική και λειτουργική ανάλυση πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας τεχνικές μεταλλαξογέννεσης Παραγωγή πρωτεϊνών με νέες ιδιότητες εφαρμόζοντας τεχνικές πρωτεϊνικής μηχανικής Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών

9 Escherichia coli: το πιο χρησιμοποιημένο βακτήριο για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Γρήγορο, φθηνό, εύκολο (όταν δουλεύει) Εύκολη κλωνοποίηση και γενετική τροποποίηση Μικρός κόστος καλλιέργειας Γρήγορη ανάπτυξη και έκφραση

10 Γενετικά ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans Aspergilus niger, Aspergillus oryzae, Pishia pastoris ……… Τεχνική κλωνοποίησης ανασυνδυασμένου DΝΑ PCR στο αντίστοιχο γένωμα Μετασχηματισμός Κυττάρων έκφρασης Αντίδραση συγκόλλησης Επιλογή πλασμιδιακού φορέα έκφρασης Επαγωγή υπερέκφρασης

11 Ετερόλογα Συστήματα Έκφρασης Πρωτεϊνών Βασικά βήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών: Απομόνωση και πολλαπλασιασμός του γονιδίου στόχου (PCR) Μεταφορά του γονιδίου σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης (pET) Μετασχηματισμός E. coli κυτταρικής σειράς έκφρασης (Bl21DE3) Μικρής κλίμακας υπερέκφραση Έλεγχος έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (ενζυμική δοκιμή, western blot) Μεγάλης κλίμακας υπερέκφραση Απομόνωση πρωτεΐνης (Χρωματογραφία)

12 Παραγωγή ανθρώπινων πρωτεϊνών μέσω γενετικά ανασυνδυασμένων μικροοργανισμών ΠρωτεΐνηΠαθήσεις α1-Αντιθρυψίνη Εμφύσημα Αδρενοκοτρικοτροπική ορμόνη Ρευματικές Παθήσεις Παράγοντας VIII Αιμοφιλία Παράγοντας ΙΧ Αιμοφιλία Ενδορφίνες Πόνος Αιμογλοβίνη Αναιμία Ινσουλίνη Διαβήτης Λεμφοτοξίνη Καρκίνος Αυξητική ορμόνη Αναπτυξιακά προβλήματα Ιντερλευκίνες Καρκίνος, Ανοσολογικές παθήσεις Ιντερφερόνες (α, β, γ) Ιώσεις, Καρκίνος Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας Εγκαύματα Νευρικός αυξητικός παράγοντας Τραύματα νευρώνων

13 Οργανισμός (Πηγή πρωτεΐνης) Ανιούσα Επεξεργασία (Έκφραση πρωτεΐνης) Κατιούσα Επεξεργασία (Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης) Καθαρό Πρωτεϊνικό Παρασκεύασμα

14 Κατιούσα Επεξεργασία Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμός Στερεών και Υγρών Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Τελικό Στάδιο Μορφοποίηση Προϊόντος

15 Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών Φυγοκέντρηση σε ειδικά δοχεία Φυγοκέντρηση συνεχούς ροής Φυγοκέντρηση Ίζημα : Ενδοκυτταρικές, μεβρανικές πρωτεΐνες Υπερκείμενο : Εξωκυτταρικές πρωτεΐνες

16 Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών Υπερδιήθηση: 0,002-0.2μm Διήθηση Μικροδιήθηση : 0,005-2μm

17 Διάρρηξη Κυττάρων Μη Μηχανικές Τεχνικές Ωσμωτικό σοκ Αλκαλική λύση (pH 11-12,5) Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (απορρυπαντικά) Οργανικοί διαλύτες (τολουόλιο, ακετόνη) Ενζυμική λύση (λυσοζύμη) Πάγωμα-ξεπάγωμα Μηχανικές Τεχνικές Εφαρμογή υπερήχων Εφαρμογή υψηλής πίεσης Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους

18 Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Εφαρμογή υπερήχων Sonicator

19 Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Εφαρμογή υψηλής πίεσης French Press Cell Press

20 Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους υαλοσφαιρίδια

21 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Ωσμωτικό σοκ Μεταφορά κυττάρων από ισοτονικό διάλυμα σε υποτονικό (απιονισμένο νερό) Χρησιμοποιειται κυρίως σε κύτταρα θηλαστικών. Για μύκητες και βακτήρια πρέπει να εχει προηγηθεί άλλη τεχνική εξασθένισης του κυτταρικού τοιχώματος για να χρησιμοποιηθει η τεχνική του Ωσμωτικού Σοκ.

22 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Πάγωμα ξεπάγωμα Freeze-thaw Εναλλαγές κυτταρικού δ/τος από ξηρό πάγο (-78 ο C) στους 37 ο C. Χρησιμοποιειται κυρίως σε κύτταρα θηλαστικών και βακτήρια.

23 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρρηξης κυττάρων Ενζυμική λύση με χρήση λυσοζύμης Υδρόλυση στρώματος πεπτιδογλυκάνης που περιβάλλει τα βακτήρια Χρησιμοποιειται κυρίως σε Gram+ βακτήρια και σε συνδυασμό με άλλη μεθοδο διάρρηξης (απορρυπαντικο, ωσμωτικό σοκ)

24 Μη Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Αλκαλικη λύση Χρήση διαλυμάτων NaOH Διαλυτοποίηση φωσφολιπιδίων κυτταροπλασματικής μεμβράνης Απαιτείται άμεση απομάκρυνση τους λόγω πρόκλησης αποδόμησης των πρωτεϊνών. Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (οργανικοί διαλύτες, απορρυπαντικά)

25 Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Κατακρήμνιση με άλατα Κατακρήμνιση με οργανικούς διαλύτες Κατακρήμνιση σε υδατικά διφασικά συστήματα Θερμική Επεξεργασία Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων (πολυαιθυλενιμίδιο, θειική στρεπτομυκίνη, βρωμιούχο κετυλο τριμεθυλαμμώνιο, πρωταμίνη, δεοξυριβονουκλεάση)

26 Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Χρωματογραφία Διαπερατότητας (gel filtration) http://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής (Ion exchange chromatography) http://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8 Χρωματογραφία Συγγένειας (Affinity chromatography) http://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y Χρωματογραφία Υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (Hydrophobic interaction) http://www.youtube.com/watch?v=FUAQKjKT99Y

27 Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Fast protein liquid chromatography FPLC

28 Τελικό Στάδιο Μορφοποίησης Προϊόντος Απομάκρυνση μικρομοριακών ουσιών (υπερδιήθηση, χρωματογραφία διαπερατότητας) Προσθήκη σταθεροποιητών ενζυμικής ενεργότητας (γλυκερόλη, άλατα, υπόστρωμα, αλβουμίνη…) Ποιοτικός έλεγχος πρωτεϊνών (ανάλογα με τις προδιαγραφές χρήσεις)

29 MINOTECH biotechnology

30 H MINOTECH biotechnology ιδρύθηκε το 1986 και αποτελεί την μονάδα παραγωγής προϊόντων με βιοτεχνολογικές εφαρμογές του ΙΜΒΒ

31 MINOTECH biotechnology Μάρκετινγκ Έρευνα και Ανάπτυξη Παραγωγή Συσκευασία και Διανομή Πιστοποίηση ISO 9001:2008 από την TUV HELLAS

32 8 Εξειδικευμένα Ένζυμα 8 Εξειδικευμένα Ένζυμα 5 κυτοκίνες 17 Αντισώματα 7 Γενικά Αντιδραστήρια 47 Περιοριστικά Ένζυμα 4 Τροποιητικά Ένζυμα DNA 12 μάρτυρες μοριακών βαρών DNA 4 είδη DNA 12 μάρτυρες μοριακών βαρών DNA και 4 είδη DNA Προϊόντα

33 Περιοριστικά ένζυμα Τα μοριακά εργαλεία που έφεραν την επανάσταση στη Μοριακή Βιολογία. Πρόκειται για τα «χημικά ψαλίδια», με τα οποία μπορούμε να κόβουμε το DNA σε συγκεκριμένα σημεία ώστε να ακολουθήσει κλωνοποίηση τους (Νομπελ Ιατρικής 1978). Alu I ApaL I Asu II Ava II BamH I Bcl I Bgl I Bgl II BseA I (BspM II) BseB I (BstN I) BseC I (Cla I) BshF I (Hae III) BsiS I (Hpa II) BssA I (Cfr10 I) BstE II CspA I (Age I) EcoR I EcoR V Hind III Hinf I Hpa I Kpn I Mbo I MspC I (Afl II) Nae I Nco I Nhe I Not I Nru I PspP I (Sau96 I) Pst I Pvu II Rsa I Sal I Sau3A I Sca I Sfi I SgrB I (Sac II) Sla I (Xho I) Sma I SnaB I Sph I SseB I (Stu I) Ssp I Sst I (Sac I) Sty I Taq I XbaI Προϊόντα

34 Τροποποιητικά ένζυμα DNA Taq DNA πολυμεράση.Το διάσημο ένζυμο που χρησιμοποιείται στην τεχνική ανίχνευσης DNA, PCR. T4 DNA λιγάση. Απαραίτητο ένζυμο στη διαδικασια κλωνοποίησης Προϊόντα DNA Methyltransferase M.BseCI. Εφαρμογές σε πειράματα επιγενετικής DNA polymerase I Large (Klenow) Fragment. Χρήσιμο ένζυμο στη διαδικασία κλωνοποίησης

35 Μάρτυρες Μοριακών Βαρών DNA Lambda DNA /StyI Lambda DNA /BstEII Lambda DNA /EcoRI Lambda DNA /HindIII pBR322/HinfIpUC19/HpaIIpUC19/BseBI/TaqI Lambda DNA /PstI Lambda DNA /HindIII/EcoRI 1kb DNA ladder Long Range DNA ladder 100bpDNA ladder Προϊόντα

36 Εξειδεικευμένα Ένζυμα (8)* HrcN Ps. syringae, Recombinant, E. coli HrpQA Ps. syringae, Recombinant, E. coli HrpQB Ps. syringae, Recombinant, E. coli MBP (Maltose Binding Protein) E. coli native protein ProOmpA (Precursor of Outer Membrane Protein) E. coli native protein SecA E. coli native protein SecA S. lividans, Recombinant, E. coli SecB E. coli native protein Κυτοκίνες (5)* IFN-γ (Interferon gamma) Human, Recombinant, E.coli IL-1α (Interleukin 1 alpha) Human, Recombinant, E.coli IL-1β (Interleukin 1 beta) Human, Recombinant, E.coli TNF-α (Tumor necrosis factor alpha) Human, Recombinant, E.coli Αντισώματα (17)* anti-E. coli SecA anti-E. coli SecB anti-GFP anti-HrcN anti-HrcQA anti-HrcQB anti-HrcU anti-HrcV anti-HrpJ anti-HrpQ anti-human Interleukin -1ß anti-human TNF-a anti-MBP anti-mouse TNF-a anti-proOmpA anti-S. lividans SecA anti-SecY Γενικά Αντιδραστήρια (7) 0.5M EDTA, pH 8.0 10mM ATP 10mM dNTP mix 1M DTT 25mM MgCl2 6X Loading Dye Solution Bovine Serum Albumin (10mg/ml) *Developed by Dr. Economou Laboratory, IMBB Προϊόντα

37 Εμπλουτισμός της λίστας μας με περιοριστικά ένζυμα με διαφορετικό τρόπο δράσης χρήσιμα στη διαδικασία κλωνοποίησης Περιοριστικά ένζυμα Έρευνα & Ανάπτυξη Αντίστροφες μεταγραφάσες Τα απαραίτητα ένζυμα σε αντιδράσεις PCR που έχουν ως μήτρα μόρια RNA

38 Τροποποιητικά ένζυμα DNA Ταυτοποίηση τροποποιητικών ενζύμων DNA από βακτήρια που απομονώθηκαν από την Ανταρκτική Ταυτοποίηση νέων θερμόφιλων ενζύμων από το υποθαλάσσιο ηφαίστειο της Σαντορίνης Έρευνα & Ανάπτυξη

39 Βιοαντιδραστήρες Ελεγχόμενη παραγωγή μικροβιακής βιομάζας σε ειδικούς βιοαντιδραστηρες χωρητικότητας 50 και 30 λίτρων. Συλλογή της μικροβιακής μάζας (φυγόκεντρος) και αποθήκευση σε ειδικούς υπερκαταψύκτες (-80 ο C). Υποδομή/Εγκαταστάσεις

40 Απομόνωση πρωτεϊνών Απομόνωση πρωτεϊνών μεγάλης κλίμακας (από mg εως gram) με χρήση τεχνικών υγρής χρωματογραφίας. Αυστηρός ποιοτικός έλεγχος των τελικών δειγμάτων και συσκευασία Υποδομή/Εγκαταστάσεις

41 Παραγωγή και διάθεση υψηλής ποιότητας ενζύμων Μοριακής Βιολογίας και σχετικών αντιδραστηρίων (αποκλειστική διάθεση σε Ελλάδα και Κύπρο από την Lab Supplies Scientific). Τμήμα έρευνας και ανάπτυξης για την εισαγωγή νέων προϊόντων. Συμμετοχή σε Εθνικά και Διεθνή Ερευνητικά Προγράμματα Με μια ματιά Συνεργασία με ερευνητικά ινστιτούτα και εταιρείες εξωτερικού Εκπαίδευση προ- και μεταπτυχιακών φοιτητών στις τεχνικές Ενζυμικής Βιοτεχνολογίας και Μοριακής Βιολογίας