Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού ΕΘΝΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΕΡΕΥΝΩΝ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ & ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΟΜΑΔΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Κωνσταντίνος Ποταμίτης, PhD

Πλάνο Παρουσίασης Βασικές Αρχές της Φασματοσκοπίας NMR Παραδείγματα Εφαρμογών

Ερευνητική Υποδομή NMR 600MHz NMR 300MHz NMR 400MHz HR LC-MS Orbitrap

Φασματοσκοπία NMR 1. Understanding NMR Spectroscopy, James Keeler, WILEY, 2005. 2. Modelling 1H NMR Spectra of Organic Compounds, Theory, Applications and NMR prediction Software, Raymond J Abraham, Mehdi Mobli, WILEY, 2008. 3. NMR – Αρχές και Εφαρμογές Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού, Θ. Μαυρομούστακος, Ι. Ματσούκας, Εκδόσεις Παρισιάνος, Αθήνα 2005. http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/ (The Basics of NMR, Joseph P. Hornak, Ph.D.) http://www.chemistry.uoc.gr/nmr/dais/ (Undergraduate Lectures, Prof. Photis Dais)

Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού NMR – Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Φαινόμενο κατά το οποίο οι πυρήνες ατόμων με αυτοστροφορμή (spin) υπό την επίδραση ισχυρού στατικού μαγνητικού πεδίου, όταν ακτινοβολούνται διεγείρονται και κατά την αποδιέγερσή τους δίνουν σήμα. Η φασματοσκοπία NMR αφορά τους πυρήνες των ατόμων και όχι τα e-

Πυρηνικός – Μαγνητικός –Συντονισμός Πυρηνικός: Ανίχνευση πυρήνων με spin. Μαγνητικός: Λήψη φασμάτων εντός μαγνητικού πεδίου. Συντονισμός: Οι πυρήνες διεγείρονται με την εκπομπή παλμών υψηλής συχνότητας προς το δείγμα και κατά την αποδιέγερση λαμβάνεται και καταγράφεται το σήμα.

Θεμελιώδης ιδιότητα όπως το ηλεκτρικό φορτίο ή η μάζα. Τι είναι Spin Θεμελιώδης ιδιότητα όπως το ηλεκτρικό φορτίο ή η μάζα. Είναι πολλαπλάσια του 1/2 και μπορεί να είναι είτε + ή -. Πυρήνες με Spin Τα πυρηνικά σωματίδια όπως και τα ηλεκτρόνια, κινούνται σε τροχιακά. Όταν ο αριθμός των πρωτονίων ή νετρονίων είναι ίσος με 2, 8, 20, 28, 50, 82, και 126, τα τροχιακά είναι συμπληρωμένα. Επειδή έχουν spin, όπως και τα ηλεκτρόνια, όταν γεμίζουν τα τροχιακά αυτά συζευγνύονται. Στον πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό, μόνο τα ασύζευκτα πυρηνικά spin παίζουν ρόλο. Σχεδόν όλα τα στοιχεία του περιοδικού πίνακα έχουν ένα ισότοπο με μη μηδενικό πυρηνικό spin. Η φασματοσκοπία NMR μπορεί να εφαρμοστεί σε ισότοπα των οποίων η φυσική του αφθονία είναι αρκετά μεγάλη για να είναι ανιχνεύσιμη.

Γενικοί Κανόνες για τον Καθορισμό του Πυρηνικού spin Το συνολικό spin, I, είναι σημαντικό. Ένας πυρήνας με spin I θα έχει 2I + 1 πιθανούς προσανατολισμούς. Για π.χ. ένας πυρήνας με spin 1/2 θα έχει 2 πιθανούς προσανατολισμούς.

Πυρήνας Ασύζευκτα πρωτόνια Ασύζευκτα νετρόνια Net Spin γ (MHz/T) 23Na 1 2 3/2 11.27 14N 1 1 1 3.08 13C 0 1 1/2 10.71 19F 1 0 1/2 40.08

Επίπεδα ενέργειας Το σπιν ενός πυρήνα το κάνει να συμπεριφέρεται ως μικρός μαγνήτης (δίπολο). Τοποθετείται σε εξωτερικό ισχυρό μαγνητικό πεδίο. Το δίπολο προσανατολίζεται σε σχέση με το εξωτερικό πεδίο. Παράλληλα = χαμηλής ενέργειας διευθέτηση (N-S-N-S) Αντιπαράλληλα = υψηλής ενέργειας διευθέτηση (N-N-S-S). Απουσία εξωτερικού Μαγνητικού πεδίου οι προσανατολισμοί αυτοί είναι ίσης ενέργειας. Παρουσία εξωτερικού Μαγνητικού πεδίου τα επίπεδα ενέργειας διαχωρίζονται. Κάθε επίπεδο έχει έναν μαγνητικό κβαντικό αριθμό , m.

Οι αρχικοί πληθυσμοί των σταθμών ενέργειας προσδιορίζονται από την κατανομή Boltzmann. Η χαμηλότερη ενεργειακά στάθμη θα περιέχει περισσότερους πυρήνες σε σχέση με την υψηλότερη ενεργειακά στάθμη. Είναι δυνατή η διέγερση των πυρήνων της χαμηλής στάθμης στην υψηλότερη με ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Η συχνότητα ακτινοβολίας καθορίζεται από την ενεργειακή διαφορά μεταξύ των σταθμών.

Αποδιέγερση Πυρήνων T1 ~ Spin – lattice (πλέγμα) relaxation Η αποδιέγερση στη φασματοσκοπία NMR δεν είναι αυθόρμητη, αλλά εξαναγκασμένη. Γίνεται με δύο διεργασίες. Κατά την πρώτη διεργασία, η οποία ονομάζεται αποδιέγερση σπιν-πλέγμα, η αποβολή της ενέργειας γίνεται με την αλληλεπίδραση των πυρήνων με ταλαντευόμενα τοπικά μαγνητικά πεδία, τα οποία δημιουργούνται από το ατομικό και ηλεκτρονιακό περιβάλλον τους (πλέγμα = lattice). Κατά την δεύτερη διεργασία, η οποία ονομάζεται αποδιέγερση σπιν-σπιν γίνεται ανταλλαγή ενέργειας μεταξύ διεγερμένων πυρήνων και πυρήνων που βρίσκονται στη βασική κατάσταση. T1 ~ Spin – lattice (πλέγμα) relaxation T2 ~ Spin – spin relaxation

Οργανολογία Φασματογράφων NMR

Ισχυρό Μαγνητικό Πεδίο

ΜRI system for human imaging 900 MHz (21.1 Tesla) superconducting NMR system for studies of various biological macromolecules at Yokohama City University Earth’s magnetic field 0.6 Gauss at equator Refrigerator magnet 100 - 150 Gauss MRI medical scanners 0.3 - 1.5 Tesla (3,000 - 15,000 G) High field NMR magnet 200 MHz 4.7 Tesla (47,000 G) 300 MHz 7.0 Tesla (70,000 G) 500 MHz 11.7 Tesla (117,000 G) 800 MHz 18.8 Tesla (188,000 G)

Βασικές παράμετροι φασμάτων NMR Χημική μετατόπιση δ (Chemical shift) Σταθερά σύζευξης J (J coupling) Ένταση κορυφής (επιφανειακό ολοκλήρωμα) Απόσταση μεταξύ πυρήνων στο χώρο (ΝΟΕ) Μοριακή δυναμική (κίνηση)

Χημική Μετατόπιση Όλοι οι ενεργοί πυρήνες ενός δείγματος δε συντονίζονται στην ίδια συχνότητα. Η ένταση του μαγνητικού πεδίου φτάνει διαφοροποιημένη σε κάθε πυρήνα. Άτομο σε μαγνητικό πεδίο. Τα ηλεκτρόνια σθένους περιστρέφονται με τη φορά του εφαρμοζόμενου πεδίου. Στους πυρήνες των ατόμων που διευθετούνται αντίθετα στο εφαρμοζόμενο πεδίο η περιστροφή τους προκαλεί ένα μικρότερης έντασης μαγνητικό πεδίο. Το μαγνητικό πεδίο που «αισθάνεται» ο κάθε πυρήνας (the effective field) είναι τελικώς μικρότερο από το εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο. Η ένταση του μικρότερου πεδίου Β1=σ Β0 (σ: σταθερά θωράκισης/προάσπισης). Η ένταση που δέχεται ένας ενεργός πυρήνας: Β=Β0-Β1 B = Bo (1-σ)

Χημική μετατόπιση δ Η συχνότητα στην οποία συντονίζεται κάθε πυρήνας και μετράται αναφορικά με τη συχνότητα συντονισμού μιας ένωσης προτύπου. Εκφράζεται σε μονάδες δ ppm (parts per million) σε σχέση με την κορυφή απορρόφησης των πρωτονίων του TMS (δ=0). Χημική μετατόπιση δ = νi / ν0 (νi : συχνότητα συντονισμού του πυρήνα, ν0 : συχνότητα του οργάνου)

Παράδειγμα Συγκεκριμένο πρωτόνιο οργανικού μορίου συντονίζεται σε συχνότητα 120 Hz σε φασματογράφο 60 ΜΗz. Ποια είναι η χημική του μετατόπιση; Λύση νi = 120 Ηz, ν0 = 60 106 Hz, δ=120/60 106= 2 ppm Το ίδιο πρωτόνιο σε φασματογράφο 100 ΜHz συντονίζεται σε συχνότητα 200 Hz. Η χημική μετατόπιση θα είναι δ= 200/100 106 = 2 ppm Η χημική μετατόπιση είναι ανεξάρτητη του οργάνου που χρησιμοποιείται.

Παράγοντες που επηρεάζουν τη χημική μετατόπιση. Ένωση δ (ppm) (CH3)4-Si 0,0 CH3-J 2,16 CH3-Br 2,65 CH3-Cl 3,10 CH3-F 4,26 Διαμαγνητική θωράκιση Συντονισμός σε Β=Β0+Β1 ~ ηλεκτρονιακή πυκνότητα Μαγνητική ανισοτροπία ~Χημικών δεσμών Επαγωγικά ρεύματα προς ορισμένες διευθύνσεις. Διαμαγνητικό ρεύμα – θωράκιση Παραμαγνητικό ρεύμα - αποθωράκιση C = C

Aσθενέστερο πεδίο Μεγάλες τιμές ppm Αποθωράκιση Υψηλότερο πεδίο Μικρές τιμές ppm Θωράκιση Κλίμακα φάσματος NMR δ (ppm)

Σταθερά σύζευξης J Σύζευξη των σπιν των πρωτονίων, στην οποία οφείλεται η πολλαπλότητα των κορυφών. Xαρακτηρίζεται από τη σταθερά σύζευξης J, η οποία ορίζεται ως η απόσταση μεταξύ των υποκορυφών που συνιστούν μια πολλαπλή κορυφή και μετράται σε μονάδες συχνότητας Ηz. Πολλαπλή κορυφή = διαφορετικοί συντονισμοί του ίδιου πρωτονίου λόγω ύπαρξης των γειτονικών. Υπολογίζεται το πλήθος των υδρογόνων που συνδέονται στους γειτονικούς άνθρακες

Δυνατοί προσανατολισμοί Και τα δύο παράλληλα στο Β0 Η3 παράλληλα – Η3’ αντιπαράλληλα στο Β0 Η3 αντιπαράλληλα - Η3’ παράλληλα στο Β0 Και τα δύο αντιπαράλληλα στο Β0

Άσκηση Τι κορυφές περιμένουμε στο 1Η NMR φάσμα της αιθανόλης; Γιατί;

Κανόνες σύζευξης Αν πυρήνας με σπιν ½ συζευγνύεται με n ισοδύναμους γειτονικούς πυρήνες, η κορυφή συντονισμού του σχάζεται σε n+1 υποκορυφές. Οι εντάσεις των κορυφών προσδιορίζονται στατιστικά και είναι ανάλογες με τους συντελεστές της διωνυμικής εξίσωσης (Τρίγωνο Pascal). 1 1 1 2 1 1 3 3 1 1 4 6 4 1 1 5 10 10 5 1 1 6 15 20 15 6 1

Φάσματα NMR 1D (1H, 13C, ..) 2D COSY 2D NOESY/ROESY 2D hsqc 2D hmbc Ταυτοποίηση Ενώσεων Διαμορφωτική Μελέτη Screening SAR by NMR Epitope Mapping Ταυτοποίηση συστατικών σε μίγμα 1D (1H, 13C, ..) 2D COSY 2D NOESY/ROESY 2D hsqc 2D hmbc STD / WaterLOGSY 2D 1H DOSY

Φασματοσκοπία NMR 3/5 Φάσματα δύο διαστάσεων : α) Ομοπυρηνικά Φάσματα δύο διαστάσεων : α) Ομοπυρηνικά Φάσματα COSY : Φάσματα TOCSY : Φάσματα ΝΟESY :

Φασματοσκοπία NMR 4/5 Φάσματα δύο διαστάσεων : β) Ετεροπυρηνικά Φάσματα δύο διαστάσεων : β) Ετεροπυρηνικά Φάσματα 2D-HSQC Φάσματα 2D-HMBC

2D-HSQC Σουκρόζης

STD NMR

Φάσματα δύο διαστάσεων DOSY παρέχουν έναν τρόπο για να διαχωριστουν οι ενώσεις σε ένα μείγμα με βάση τους διαφορετικούς συντελεστές διάχυσης που εξαρτάται απο : Διαφορές στο μέγεθος και το σχήμα του μορίου Ιξώδες Θερμοκρασία