Εισαγωγή νέων αλληλουχιών στο γονιδίωμα

Συγκεκριμένα γονίδια μπορούν να εισαχθούν στη γεννητική σειρά ποντικών Τα γονίδια εισάγονται με ομόλογο ανασυνδυασμό στα γεννητικά κύτταρα ποντικού Παράγονται διαγονιδιακά ζώα Πειραματικό σύστημα μελέτης ανάπτυξης, συμπεριφοράς και φυσιολογίας θηλαστικών και μοριακής βάσης γενετικών νοσημάτων

Εισαγωγή γονιδίων σε πρώιμα έμβρυα ζώων Εισαγωγή γονιδίων σε πρώιμα έμβρυα ζώων. Μελέτη λειτουργικού ρόλου γονιδίου στο επίπεδο του οργανισμού. Δημιουργία διαγονιδιακών ποντικών. Μελέτη λειτουργικού ρόλου γονιδίου στο επίπεδο του οργανισμού Εισαγωγή εξωγενούς DNA (ανασυνδυασμένων γονιδίων-διαγονιδίων) κατευθείαν σε έμβρυα διαφόρων σταδίων και ενσωμάτωση στο γονιδίωμά τους (διαγονιδιακά ζώα). Εναλλακτική μεθοδολογία: εισαγωγή εξωγενούς DNA σε εμβρυικά βλαστικά κύτταρα ~ 40% των ατόμων που επιβιώνουν φέρει το εξωγενές DNA ενσωματωμένο στο γονιδίωμά του.

Δημιουργία διαγονιδιακών και knock-in/knockout ποντικών Α) Ανασυνδυασμένο DNA που φέρει τη γενετική πληροφορία υφίσταται χειρισμούς πριν ενεθεί σε προπυρήνα γονιμοποιημένου ωαρίου. Η ενσωμάτωση γίνεται τυχαία στο γονιδίωμα του ωοκυττάρου που κατόπιν αναπτύσσεται σε έμβρυο και εμφυτεύεται. Το διαγονιδιακό ποντίκι που προκύπτει φέρει το ανασυνδυασμένο διαγονίδιο σε τυχαία θέση αλλά αυτό εκφράζεται. (B) Δημιουργία knock-in ή knockout μοντέλου ποντικού. Δημιουργείται κάποια κατασκευή που φέρει ομόλογες περιοχές με την περιοχή στην οποία θέλουμε να εισαχθεί και έναν δείκτη επιλογής (ανθεκτικότητα σε κάποιο φάρμακο). Ο φορέας αυτός εισάγεται σε εμβρυικά βλαστικά κύτταρα ποντικού(ES). Γίνεται επιλογή με αντιβιοτικό. Τα ES εγχύονται σε πρώιμο έμβρυο, και γίνεται εμφύτευση. Τα χιμαιρικά ποντίκια ( μίγμα τροποποιημένων κυττάρων ES και κυττάρων του ξενιστή έχουν δύο χρώματα . Μετά από γονιμοποίηση με φυσιολογικά προκύπτουν ποντίκια που προήλθαν από τα τροποποιημένα κύτταρα ES που φέρουν την γενετική τροποποίηση (τροποποιημένο γονίδιο: knockin ή έλλειμμα γονιδίου: knockout).

Η άμεση μεταφορά DNA στους προπυρήνες γονιμοποιημένων ωαρίων μπορεί να δώσει διαγονιδιακά ζώα αλλά δεν επιτρέπει την επιλογή της θέσης στην οποία θα εντεθεί το DNA ή τη δυνατότητα ελεγχόμενης τροποποίησης συγκεκριμένων ενδογενών γονιδίων. Για να επιτευχθεί αυτό το DNA αρχικά εισάγεται σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα.

Δημιουργία εκμηδενιστικού αλληλομόρφου (null allele)γονιδίου-διερεύνηση λειτουργίας γονιδίου in vivo Παρεμβολή εξωγενούς DNA μέσα σε γονίδιο με αποτέλεσμα τη δημιουργία αλληλομόρφου που δεν μπορεί να καθοδηγήσει τη σύνθεση λειτουργικού προϊόντος. Η διασταύρωση ζώων που είναι ετερόζυγα για εκμηδενιστικό αλληλόμορφο οδηγεί στη δημιουργία ζώου ομόζυγου που δεν φέρει κανένα ενεργό αντίγραφο του υπό μελέτη γονιδίου (Knock-out)

Γονιδιακή στόχευση = ελεγχόμενη εισαγωγή συγκεκριμένων τροποποιήσεων σε συγκεκριμένο γενετικό τόπο Η γονιδιακή στόχευση χρησιμοποιείται -για την απενεργοποίηση γονιδίων μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού (στοχευμένη αδρανοποίηση(gene knock-out) -για την αντικατάσταση ενδογενούς γονιδίου από εξωγενές.

Δημιουργία κατασκευής για εισαγωγή διαγονιδίου Για τον χαρακτηρισμό των κυττάρων στα οποία έγινε ο.α. χρησιμοποιούνται στην κατασκευή 2 δείκτες επιλογής Ο ένας παραμένει ενσωματωμένος στο υπό μελέτη γονίδιο Ο άλλος χάνεται κατά τον ομόλογο ανασυνδυασμό Σε ένα μικρό ποσοστό των διαμολυθέντων κυττάρων το εισαγόμενο DNA ανασυνδυάζεται (ομόλογος ανασυνδυασμός) με το γονίδιο-στόχο αν και συχνότερα συμβαίνει ανασυνδυασμός σε μη-ομόλογες περιοχές των χρωμοσωμάτων

Δημιουργία κατασκευής για εισαγωγή διαγονιδίου Επιλογή: χρησιμοποιούνται στην κατασκευή 2 γονίδια-δείκτες, ένα μέσα στο γονίδιο-στόχο και ένα έξω από την αλληλουχία του γονιδίου στόχου Δημιουργία εκμηδενιστικού αλληλομόρφου(null allele): γονίδιο-δείκτης ενσωματώνεται σε ένα από τα εξόνια, διακόπτει την έκφραση του γονιδίου Σε μικρό ποσοστό των διαμολυθέντων κυττάρων έχουμε ομόλογο ανασυνδυασμό και εισαγωγή του γονιδίου-στόχου neo: ανθεκτικότητα σε G-418 ευαισθησία σε ganciclovir Μόνο τα βλαστικά κύτταρα με ομόλογο ανασυνδυασμό επιβιώνουν παρουσία και των δύο Μόνο τα κύτταρα με ομόλογο ανασυνδυασμό επιβιώνουν παρουσία G-418 και ganciclovir.

Στοχευμένη αδρανοποίηση (Knock-out) neor(εντός ομόλογης περιοχής): αντίσταση σε G-418 tkHSV: γονίδιο ο κινάσης της θυμιδίνης του herpes simplex virus. Το ιϊκό γονίδιο μετατρέπει το νουκλεοτιδικό ανάλογο ganciclovir στη μονοφωσφορική του μορφή που μετατρέπεται στην τριφωσφορική η οποία αναστέλλει τον κυτταρικό αναδιπλασιασμό DNA στα ES κύτταρα. Ganciclovir: κυτταροτοξικό για τα ανασυνδυασμένα ES κύτταρα με το tkHSV γονίδιο Μόνο κύτταρα με μη ομόλογη ένθεση είναι ευαίσθητα στο ganciclovir Μόνο τα κύτταρα με ομόλογο ανασυνδυασμό επιβιώνουν παρουσία G-418 και ganciclovir. Στα κύτταρα αυτά το ένα αλληλόμορφο του γονιδίου Χ διακόπτεται.

Ομόλογος ανασυνδυασμός (ο.α.) 1 γεγονός ο.α. κάθε 1000 γεγονότα ετερόλογου Αν η κατασκευή DNA είναι κατάλληλη: συχνότητα ομόλογης ενσωμάτωσης: 5-20% του συνόλου των ενθέσεων

Ανασυνδυασμός ειδικής θέσης- Site specific recombination

Aνασυνδυασμός σε ειδική θέση-Site specific recombination (προκαρυωτικά + ευκαρυωτικά κύτταρα) Ο ομόλογος ανασυνδυασμός γίνεται τυχαία μεταξύ 2 ομόλογων τμημάτων DNA και υπάρχει σχετικά μικρή ειδικότητα ως προς το σημείο του επιχιασμού Στον ειδικό ανασυνδυασμό σχετικά μικρές, μοναδικές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες σε δύο μόρια DNA αναγνωρίζονται από ένζυμα που λέγονται ρεκομπινάσες (recombinases) που αναγνωρίζουν, κόβουν και ανασυνδυάζουν τις αλληλουχίες αυτές σε δύο διαφορετικά μόρια DNA.

Σύστημα loxP/ Cre Η ρεκομπινάση Cre που κωδικοποιείται από τον βακτηριοφάγο Ρ1 καταλύει τον ανασυνδυασμό ανάμεσα σε 2 αλληλουχίες-στόχους, καθεμια από τις οποίες αποτελείται από μια αλληλουχία που ονομάζεται loxP. Το σύστημα loxP/ Cre χρησιμοποιείται στα ευκαρυωτικά κύτταρα ως σημαντική τεχνική ανασυνδυασμού ειδικής θέσης.

Αδρανοποίηση γονιδίων-στόχων σε ειδικούς τύπους σωματικών κυττάρων ή σε συγκεκριμένα στάδια της ανάπτυξης Παραγωγή knockout μεταλλάξεων (germ-line) δεν είναι χρήσιμη για τη μελέτη συγκεκριμένου ιστού σε συγκεκριμένο στάδιο ανάπτυξης ή άλλο. Σύστημα ανασυνδυασμού P1 loxP-Cre ιδιαίτερα χρήσιμο για γενετικές μελέτες σε ποντικούς διότι επιτρέπει την παραγωγή ποντικών με έλλειψη(knockout) ενός μόνο γονιδίου που μας ενδιαφέρει από συγκεκριμένο ιστό

loxP-Cre σύστημα ανασυνδυασμού Η έκφραση του Cre ελέγχεται από ειδικό για τον τύπο του κυττάρου υποκινητή (promoter) loxP-Cre ποντίκια η αδρανοποίηση γονιδίου (Χ) γίνεται μόνο σε κύτταρα με ενεργό υποκινητή που ελέγχει το γονίδιο cre

Ειδικές θέσεις ανασυνδυασμού (loxP) Ένζυμο που καταλύει τον ανασυνδυασμό μεταξύ τους- Cre. Η έκφρασή του ελέγχεται από ειδικό για τον τύπο του κυττάρου υποκινητή Το γονίδιο Χ είναι αδρανοποιημένο μόνο σε κύτταρα με ενεργό για Cre υποκινητή

Σύνδρομο DiGeorge/Del 22q11(3Μb) Δημιουργία ποντικού μοντέλου                          Σύνδρομο DiGeorge/Del 22q11(3Μb) Δημιουργία ποντικού μοντέλου Παρασκευάστηκαν κύτταρα ES ποντικού με θέσεις loxP εκατέρωθεν της γενωμικής περιοχής της ομόλογης με την περιοχή 22q11 του ανθρώπου. Χρησιμοποιήθηκε η πρωτεϊνη Cre και δημιουργήθηκε αντίστοιχο έλλειμμα Οι σειρές κυττάρων ES που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία γενετικά τροποποιημένων ποντικών. Τα ομόζυγα ζώα πέθαιναν κατά την κύηση. ~1/4 ετερόζυγων εμφάνιζαν τις καρδιακές βλάβες- Μοντέλο μελέτης

Παράδειγμα: Κυστική ίνωση Γενετικό νόσημα Χρησιμοποιώντας το κλωνοποιημένο wild-type ανθρώπινο CFTR απομονώθηκε το ομόλογο cftr στο οποίο εισήχθησαν μεταλλάξεις (knockout) ομόζυγα μεταλλαγμένα ποντίκια με φαινότυπο CF χρησιμοποιούνται σαν μοντέλο για τη μελέτη και γονιδιακή θεραπεία του νοσήματος